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[후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트] #10_CD4 T cell 분화_완결
Bio통신원(박은총)
이번 글을 통해 쥐에서 얻은 CD4 T cell을 In vitro 분화시키는 실험에 대해 소개하려고 합니다. 물론 다른 면역세포를 키우고 분화시키는 실험도 중요하지만, 제가 연구하는 세포가 CD4 T cell이라서 다른 면역세포에 대한 노하우는 상대적으로 많지 않습니다. 따라서 CD4 T cell 분화에 대한 이론을 설명하고 이에 필요한 실험적 방법과 노하우들을 소개하면서 연재를 종료하려고 합니다.
1. CD4 T cell 분화에 필요한 신호
실험에 대한 이야기를 하기에 앞서 우선 CD4 T cell을 키우는데 필요한 요소들에 대해 살펴보려고 합니다. 면역학 교과서를 통해서도 배울 수 있는 내용이고 CD4 T cell을 연구하는 분들은 이미 알고 있겠지만, CD4 T cell은 크게 세 종류의 신호가 필요합니다. T cell receptor(TCR)이 활성화되면서 전달되는 TCR 신호, CD28이 활성화되어 전달되는 공동자극신호 (Co-stimulatory signal), 마지막으로 분화의 방향을 결정짓는 사이토카인(Cytokine)에 의한 신호가 필요합니다.
1) TCR signal
T cell이 발현하는 TCR은 특정 항원을 인식할 때 활성화됩니다. B cell의 경우 특정 항원의 3차원 구조를 인식해서 항원과 BCR이 직접적으로 결합하지만, TCR은 조금 다른 방식으로 작동합니다. 우선 항원 자체를 인식하는 것이 아니라 항원에서 유래한 펩타이드 조각을 인식합니다. 항원제시세포(Antigen presenting cell, 이하 APC로 표기)가 항원을 작은 펩타이드 조각들로 분해한 후 펩타이드 조각을 MHC에 올려 제시하고, MHC와 peptide 복합체가 TCR과 일정 수준 이상의 결합 친밀도를 가지면 TCR이 활성화됩니다. 이는 CD4 T cell과 CD8 T cell에 공통적으로 적용되는 사항입니다. 다만 CD4 T cell은 MHCII에 올려진 펩타이드를 인식하고 CD8 T cell은 MHCI에 올려진 펩타이드를 인식한다는 차이점이 있습니다.
2) Co-stimulatory signal
TCR 활성화가 일차적으로 T cell의 활성에 필요한 신호를 전달하지만, TCR 신호만 받은 T cell은 제대로 된 T cell 활성화를 일으킬 수 없습니다. CD28을 통한 추가적인 공동 자극이 필요한데, 이는 T cell이 활성화되는데 필요한 추가적인 체크포인트를 가짐으로써 무분별한 T cell 활성화를 차단하고 검증된 T cell만이 활성화되도록 하는 정교한 시스템입니다. T cell의 CD28은 APC가 발현하는 CD80이나 CD86과 결합할 때 활성화가 되며, 이를 통한 Co-stimulatory signal과 TCR signal이 함께 전달될 때 비로소 제대로 된 T cell 활성화가 일어납니다. 이 점 역시 CD4 T cell과 CD8 T cell에 공통적으로 적용되는 사항입니다.
3) Cytokines
CD4 T cell의 또 다른 이름은 Helper T cell (Th cell)입니다. Th cell은 다양한 아형(Subset)을 가지는데, 이 아형들은 다양한 Cytokine에 의해 분화가 유도됩니다. 각 아형의 분화를 유도하는 Cytokine을 설명하기에 앞서 각 아형을 먼저 소개할 필요가 있습니다. Th cell의 아형을 나누는 기준은 일반적으로 CD4 T cell이 발현하는 Cytokine이나 전사조절인자(Transcription factor)의 종류입니다 (표 1).
표 1에서 크게 다섯 가지의 아형을 소개하지만, 실제로는 이 밖에도 추가적인 아형들이 존재합니다. 게다가 같은 아형으로 묶인 세포라 하더라도 발현하는 Cytokine 종류나 양의 차이가 있기 때문에 (Heterogenous) 여기서 소개하는 기준들이 절대적인 기준이라고 할 수는 없습니다. 또한 여기서 소개하는 Cytokine들은 대표적인 일부만 소개하는 것입니다.
먼저 Th1 cell의 경우 IFN-γ를 만들어내고, Th1 cell 분화를 결정짓는 전사조절인자는 T-bet입니다. IL-12에 의해 분화가 유도되며, Th1 cell이 만들어내는 IFN-γ는 다시 Th1 cell 분화에 도움을 줍니다. 또한 IL-4에 의해 Th1 cell 분화가 저해됩니다.
Th2 cell의 경우 전사조절인자인 GATA3에 의해 분화가 결정되며, IL-4, IL-13 등의 사이토카인을 만들어냅니다. Th2 cell의 분화를 유도하는 Cytokine은 IL-4이며, Th2 cell 분화는 IFN-γ에 의해 저해되기 때문에 Th1 cell과 Th2 cell은 서로 상대의 분화를 저해하는 상호 배타적인 세포입니다.
Th17 cell은 기본적으로 IL-17A의 발현과 전사조절인자인 RORγt를 발현하는 Th cell로 정의됩니다. 하지만 In vivo에서와 In vitro에서 Th17 cell이 만드는 Cytokine에는 차이가 있고, 분화를 유도하는 Cytokine에도 약간의 차이가 존재합니다. 실제 몸 안에서 존재하는 Th17 cell의 경우 기본적으로 IL-17A를 만들지만 상황(염증 혹은 평상시)과 장소(조직)에 따라 공동 발현하는 Cytokine이 다양해집니다. 예를 들어 장에서 평소 존재하는 Th17 cell의 경우 IL-17A. IL-21, IL-22 등을 발현합니다. 반면 염증 상황에서 염증 장소에 있는 Pathogenic Th17 (pTh17) cell의 경우 IL-17A와 함께 GM-CSF, IFN-γ, TNF-α 등의 염증성 사이토카인을 공동 발현하기도 합니다. Th17 cell 분화에 있어서 IL-6와 TGF-β가 핵심적인 역할을 수행하며, 이들은 모두 RORγt 발현을 일으킵니다. 다만 pTh17 cell을 유도할 경우에는 IL-1β와 IL-23이 추가적으로 필요합니다. In vitro에서 Th17 cell을 유도할 때도 IL-6와 TGF-β가 필요하며, 이렇게 분화된 세포는 IL-17A를 높게 발현합니다. In vitro에서 pTh17 cell을 유도할 경우에는 IL-6, IL-1β, IL-23이 필요하며, TGF-β는 연구실마다 넣기도하고 빼기도합니다. 또한 In vitro에서 분화된 pTh17 cell의 경우 IL-17A와 GM-CSF를 높게 발현합니다.
Treg cell(T regulatory cell)의 경우 TGF-β, IL-10 등의 항염증성 사이토카인을 발현할 수 있지만, 실제로 이를 발현하지 않는 Treg cell도 많고 그 발현양이 매우 적기도 합니다. 따라서 일반적으로 Treg cell을 규정지을 때는 Cytokine보다는 FOXP3 발현을 더 중요한 마커로 사용합니다. 몸안에서 만들어지는 Treg cell은 그 출처에 따라 흉선유래(Thymic) Treg cell 또는 말초유래(Peripheral) Treg cell로 분류합니다. 표에서는 In vitro에서 분화유도되어 만들어지는 Treg cell이라서 Induced Treg cell로 표기하였습니다. TGF-β는 앞서 Th17 cell에서 IL-6와 함께 RORγt 발현을 유도했지만, IL-6에 의한 신호가 없이 단독으로 작동할 때는 FOXP3의 발현을 유도해 Treg cell로 분화를 유도합니다.
2. Naïve CD4 T cell 분리 방법
이제부터는 실험 기법에 대한 이야기로 넘어가도록 하겠습니다. In vitro에서 CD4 T cell을 Th cell로 분화시키기 위해서는 우선 Naïve CD4 T cell을 분리해 내야 합니다. Naïve CD4 T cell이란 항원을 경험하지 못한 미경험 CD4 T cell을 의미하며, 흉선에서 만들어진 이후 아직 항원에 의해 활성화된 적이 없기 때문에 CD62L을 높게 발현하고 CD44를 낮게 발현합니다. CD62L은 CD4 T cell이 Lymph node로 이동해서 체류하는데 필요하며, CD44는 활성화된 CD4 T cell이 Lymph node를 떠나 목적지로 이동하는데 필요합니다. 따라서 Naïve CD4 T cell은 CD62LhiCD44lo CD4 T cell로 정의됩니다.
정확한 실험을 위해서는 (다른 목적이 있는 경우가 아니라면) 전체 CD4 T cell (Pan CD4 T cell)이 아니라 Naïve CD4 T cell만을 분리해 내서 분화 실험을 해야 합니다. Pan CD4 T cell을 살펴보면 이 중에서 Naïve CD4 T cell은 60~80% 정도이며, 나머지는 활성화된 Effector CD4 T cell, Memory CD4 T cell, Treg cell 등이 차지합니다. 특히나 Treg cell의 경우 Pan CD4 T cell에서 약 10% 정도를 차지할 만큼 비중이 높습니다. 따라서 Pan CD4 T cell을 이용해 분화 실험을 하면 Effector CD4 T cell에서 나오는 Cytokine과 Treg cell의 영향으로 분화율이 높지 않습니다.
Naïve CD4 T cell을 얻는 과정은 크게 1) Magnetic beads를 이용하는 방법과 2) FACS를 이용하는 방법이 있습니다. 제가 속한 실험실에서는 Magnetic beads를 이용해 1차로 Pan CD4 T cell을 분류한 후 추가적으로 Naïve CD4 T cell 마커를 형광항체로 표지한 후 FACS sorting을 진행합니다.
1) Magnetic beads를 이용한 CD4 T cell 분류
기본적인 원리는 크게 Positive selection 방법과 Negative selection 방법이 있습니다. Positive selection은 내가 원하는 세포를 인식하는 항체에 Magnetic beads를 결합시킨 후 Beads가 붙은 세포를 자석으로 분리해 내는 방법이며, Negative selection은 반대로 내가 원하지 않는 세포에 Magnetic beads가 붙은 항체를 붙인 후 자석으로 분리해 내는 방법입니다 (그림 1). CD4 T cell을 예로 든다면 CD4를 인식하는 항체에 Magnetic beads를 붙여 CD4를 발현하는 세포를 얻어낼 수 있습니다 (Positive selection). 또 반대로 CD4 T cell이 발현하지 않는 마커들만 (예: CD8, CD11b, CD19, CD24, CD45R, CD49b, Ly6G, TCRγδ, TER-119, 출처: MagniSort Mouse CD4 T cell Enrichment Kit) 인식하는 항체에 Magnetic beads를 붙여 CD4 T cell만 남기고 나머지 세포를 분리해낼 수도 있습니다 (Negative selection). Negative selection 방법을 이용해 Naïve CD4 T cell을 분리하는 제품의 경우 CD44를 인식하는 항체를 추가해 줌으로써 CD44를 발현하는 CD4 T cell까지 제거하고 높은 비율로 Naïve CD4 T cell만을 남길 수도 있습니다. Miltenyi Biotec에서 개발한 MACS(Magnetic-activated cell sorting) 제품이 이 분야를 선도했고 지금은 다양한 회사에서 다양한 제품들을 만들고 있습니다. MACS는 컬럼을 사용하는 특징이 있고, Invitrogen이나 STEMCELL 등의 회사에서 만드는 제품들은 일반적인 5 mL FACS tube를 이용하는 특징이 있습니다.
2) FACS sorting을 이용한 CD4 T cell 분류
앞서 소개한 Magnetic beads를 이용한 세포 분리는 지금에서야 쉽게 사용하는 기술이지만 개인적으로는 아주 혁신적인 실험 기법이라 부르고 싶습니다. 하지만 이러한 방법은 결코 완벽하지 않습니다. 분리해낸 세포에서 실제로 원하는 세포는 90% 정도이며 나머지 10% 정도는 원하지 않는 세포들이 함유되어 있습니다. 이러한 문제를 해결할 수 있는 방법이 FACS sorting입니다. FACS sorting은 이전에 Flow cytometry를 소개하는 글에서 간략하게 소개한 적이 있는데, 형광표지된 항체가 붙은 세포들 중에서 원하는 세포만 분리해 내는 매우 혁신적인 기술입니다.
제가 속한 실험실에서는 Magnetic beads를 이용해 Pan CD4 T cell을 우선 분리한 후 CD4, CD25, CD44, CD62L에 대한 형광항체와 Viability dye로 세포를 염색한 후 CD4+ CD25- CD62Lhi CD44lo cell을 FACS sorting 합니다. 처음 CD4 T cell 분리를 배우는 사람들은 이 부분에서 '처음부터 FACS로 세포를 얻어내면 안 되냐'고 묻곤 합니다. 굳이 Magnetic beads로 분리해낸 세포를 또다시 FACS로 분리해 내는 불편함을 감수하는 것은 순도(Purity)를 높이기 위함입니다. FACS sorting이 아주 훌륭한 기술이지만 분리하고자 하는 세포의 비율이 낮은 경우 Sorting의 정확성 및 효율(속도 및 회수율)이 떨어집니다. Lymph node에서 얻는 세포들의 약 20~30% 정도가 CD4+ T cell이며 Spleen에서 얻는 세포들에서는 약 10~20% 정도가 CD4+ T cell입니다. 그리고 CD4+ T cell에서 대략 70%정도가 Naïve CD4 T cell입니다. 따라서 처음부터 FACS sorting으로 Naïve CD4 T cell을 분리한다면 전체 세포에서 Naïve CD4 T cell이 차지하는 비율이 낮아 효율이 감소합니다. 따라서 높은 순도의 Naïve CD4 T cell을 얻기 위해 두 단계(Magnetic beads-based sorting + FACS sorting)를 거칩니다.
CD25를 발현하는 CD4 T cell은 대부분이 Treg cell입니다. 보다 효율적으로 Naïve CD4 T cell을 얻기 위해 CD25에 대한 항체도 추가적으로 넣는 것이지만 필수적인 것은 아닙니다. 하지만 사용하는 것을 추천합니다. 또한 형광항체 사용으로 인해 세포에 남아있을 형광에 대한 우려가 있을 수도 있지만 CD4를 제외한 나머지는 걱정하지 않으셔도 됩니다. CD25와 CD44의 경우 각 마커를 발현하지 않는 세포를 얻는 것이기에 형광항체가 붙어있지 않습니다 (비특이적으로 어느 수준은 붙어있지만 무시할 수준입니다). 또한 CD62L의 경우 CD4 T cell이 활성화되면 Ectodomain shedding이라는 과정을 통해 세포 표면에서 하루도 안 돼 떨어져 나갑니다. 따라서 CD62L에 붙은 형광항체도 걱정이 되지 않습니다. 다만 CD4에 붙은 형광항체는 며칠이 지나도 어느 정도 검출이 됩니다. 따라서 이후 세포를 분석할 때는 FACS sorting에 사용한 anti-CD4 항체와 동일한 형광항체를 사용하는 것이 좋습니다.
3. CD4 T cell 활성화 방법
Naïve CD4 T cell을 얻었다면 이제 세포를 이용해 실험을 하면 됩니다. 앞서 CD4 T cell은 세 가지의 신호를 필요로 한다고 설명하였습니다. 그중에서 TCR signal과 Co-stimulatory signal은 Th subset 종류에 상관없이 공통적으로 분화에 필요합니다. In vitro에서 TCR signal과 Co-stimulatory signal을 주는 방법은 다양합니다. 크게 세 가지 방법을 소개하고자 합니다.
1) Plate-bound anti-CD3/CD28 antibody를 이용한 Culture
가장 일반적인 방법이라 할 수 있는 방법이 Plate에 코팅된 anti-CD3ε antibody와 anti-CD28 antibody를 이용한 방법입니다. 앞서 CD4 T cell의 TCR이 활성화되려면 TCR이 인식할 수 있는 펩타이드가 올라간 MHCII와 TCR이 결합해야 한다고 설명하였습니다. 하지만 쥐에서 얻어낸 CD4 T cell들은 특별히 면역반응이 일어나지 않는 한 대부분이 겹치지 않는 고유의 클론들이며, 따라서 거의 모든 CD4 T cell은 각자 자신만이 반응하는 펩타이드를 갖습니다. 따라서 서로 다른 TCR을 갖는 CD4 T cell의 TCR을 항원을 이용해 모든 CD4 T cell을 활성화시키는 것은 불가능합니다. 하지만 TCR 신호가 전달되는 기전을 이해한다면 TCR과 MHCII의 결합을 우회해서 TCR 신호를 전달할 수 있고, 그것이 바로 CD3를 활성화시키는 방법입니다.
TCR 활성의 핵심은 바로 Clustering(군집화)입니다. T cell과 APC가 접촉하는 국소적인 위치에 많은 TCR이 모이는 물리적인 과정이 TCR 신호전달에 필요합니다. 이렇게 TCR이 모여서 군집을 이루면, 그 주변에는 네 개의 사슬(CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ)로 구성된 CD3 복합체가 마찬가지로 군집을 형성합니다. 이렇게 모여든 CD3 복합체는 다량의 ITAM(Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)을 보유하는데, CD3 복합체가 군집화를 이룰 때 ITAM의 인산화가 일어납니다. 그리고 이곳으로 Zap-70 같은 인산화효소들이 모여들면서 TCR 신호전달이 시작됩니다. 따라서 CD3 복합체의 군집화를 실험적으로 구현할 수만 있다면 MHC와 펩타이드 없이도 TCR 신호전달을 일으킬 수 있게 됩니다. CD3 복합체 군집화를 위해서 사용하는 항체가 바로 anti-CD3ε antibody입니다. 그리고 군집화를 이루기 위해서는 anti-CD3ε antibody가 한 곳에 모여서 붙어있어야(고정되어있어야)합니다 (Immobilized) (그림 2). 이런 이유로 항체를 Plate 바닥에 코팅하는 것입니다. 같은 이야기이지만 항체를 코팅하지 않고 그냥 넣어주면 CD3 복합체 군집화가 이루어지지 않아 T cell 활성화가 유도되지 않습니다 (사람의 T cell을 활성화시키는 Anti-CD3 antibody 중에서는 수용성 형태로도 T cell 활성화를 유도시킬 수 있는 클론이 있습니다).
항체를 바닥에 코팅해 주는 방법은 간단합니다. PBS에 항체를 일정 비율로 희석해 준 후 이를 Plate에 처리해 준 후 몇 시간을 기다리면 됩니다. 하지만 여러 가지 변수들이 있습니다. 가장 우선적으로 온도와 시간이 변수입니다. 일반적으로 4℃ 냉장고에서는 하루 동안 두거나 37℃ 인큐베이터에서는 최소 1시간을 둡니다. 어떤 방법이 더 좋다고 말할 수는 없지만 가능한 한 방법을 택해서 일관성 있게 사용하는 것이 좋습니다. 개인적으로는 인큐베이터에 1~2시간 정도 코팅하는 것을 추천드립니다. 실험에 소요되는 시간이 적기 때문입니다. 그리고 코팅 시간에 따른 T cell 활성화 정도를 직접적으로 비교해 보지는 않았지만 2시간만 코팅해도 CD4 T cell을 분화시키기에 충분합니다. 코팅 시간을 늘리면 물론 Plate에 붙을 항체의 양이 증가하겠지만 일정 시간이 지나면 항체가 붙는 속도가 느려지고 코팅양의 증가폭은 감소하기 때문에 큰 효과를 기대하기 어렵습니다. 대부분의 항체는 아주 즉각적으로 빠르게 Plate에 결합합니다. 그럼에도 불구하고 몇 시간을 두는 것은 조금 더 효율을 올리고자 함입니다. 극단적인 예를 들어 (실제 측정한 데이터 값이 아니라 예시를 드는 것입니다) 코팅될 항체의 50%는 5분 안에 플레이트를 코팅하고 나머지 50%가 추가적으로 플레이트를 코팅하는데 1시간이 걸린다고 이해를 해도 됩니다.
흥미롭게도 Plate 제조사에 따라서도 코팅 효율이 달라집니다. 이런 이유로 가급적이면 Plate 브랜드를 중간에 바꾸지 않는 것이 좋습니다. 그리고 새로운 브랜드의 Plate를 사용할 계획이라면 코팅이 잘 되는지를 반드시 확인해 봐야 합니다.
Anti-CD3ε antibody를 Plate에 직접 코팅하는 방법도 있지만, 사실 더 추천드리는 방법은 Secondary antibody(Anti-Hamster IgG)를 코팅하는 것입니다. Secondary antibody를 먼저 코팅한 후 Anti-CD3ε antibody와 Anti-CD28 antibody를 Media에 섞어서 넣어주면 결국 항체들이 바닥에 붙어 동일한 효과를 보입니다. 하지만 Anti-CD3ε antibody를 직접 코팅하는 경우보다 코팅 효율이 올라가기 때문에 훨씬 적은 양으로 더 높은 T cell 활성화를 유도합니다 (그림 3). 따라서 Anti-CD3ε antibody를 Plate에 직접 코팅하기보다는 Secondary antibody를 코팅해서 Anti-CD3ε antibody가 Secondary antibody에 의해 바닥에 고정되도록 하는 것을 추천드립니다. 또한 Anti-CD28 antibody에 의한 공동 자극이 TCR 활성을 증가시키기 때문에 (그림 4) 적정 수준의 Anti-CD28 antibody를 넣어주는 것이 중요합니다.
2) Beads를 이용한 Culture
Anti-CD3ε antibody와 Anti-CD28 antibody가 붙어있는 Beads를 이용해서도 TCR을 활성화시킬 수 있습니다. Beads를 이용하는 것의 원리는 앞서 설명한 것과 동일하게 CD3의 군집화를 형성하는 것입니다. 다만 Anti-CD3ε antibody와 Anti-CD28 antibody가 이번에는 Plate 바닥에 붙는 것이 아니라 아주 작은 Beads에 결합되어 있는 것이 차이점입니다. 이렇게 해줌으로써 마치 APC와 T cell이 상호작용하는 과정을 조금 더 물리적인 측면에서 모방할 수 있습니다. 하지만 제품으로 만들어져 나오기 때문에 Beads에 붙은 Anti-CD3ε antibody와 Anti-CD28 antibody의 비율을 임의로 조절할 수 없다는 단점이 있습니다. 그럼에도 불구하고 실험 목적에 따라서 Beads를 이용해서도 TCR 활성을 유도할 수 있습니다.
3) Mitomycin C-treated splenocytes를 이용한 Culture
Beads를 사용하는 방법이 비교적 T cell과 APC의 물리적 상호작용을 모방한다고 하지만 결코 완벽하다고 할 수는 없습니다. 면역 시냅스가 형성되는 과정에 다양한 분자들이 관여하기도 하고 T cell이 분화하는 과정에서 APC가 만들어내는 Cytokine이 중요한 역할을 하기 때문입니다. 보다 조금 더 생체 내에서 일어나는 것을 모방하기 위해서 Splenocytes를 사용해서 T cell을 활성화시킬 수 있습니다.
이 방법도 마찬가지로 Anti-CD3ε antibody를 넣어줌으로써 TCR의 활성을 유도합니다. 대신 이번에는 Anti-CD3ε antibody가 Splenocytes의 Fc receptor에 붙어서 CD3의 군집화를 유도합니다. Splenocytes가 Beads 역할을 수행하는 것입니다. 비록 Anti-CD3ε antibody는 Hamster 유래 항체이지만 Splenocytes에 있는 Fc receptor에도 붙어서 Plate나 Beads를 코팅한 것과 마찬가지로 작동합니다(Austyn et al., 1987; Duhen et al., 2013). 그리고 이 경우 Anti-CD28 antibody는 넣어주지 않아도 됩니다. Splenocytes가 발현하는 CD80과 CD86에 의해 Co-stimulatory signal이 전달되기 때문입니다.
대신 이 방법을 사용할 때는 보통 Splenocytes에 Mitomycin C를 처리하거나 Irradiation을 통해 DNA에 손상을 줘 Splenocytes가 더 이상 분열하지 못하도록 해줍니다. Mitomycin C는 항암제로 사용되는 약물로서 DNA에 손상을 주며, Splenocytes에 보통 1시간 정도 처리해 줍니다. 이후에 T cell과 Splenocytes를 섞기 전에 Mitomycin C를 제거해 주어야 합니다. T cell은 분열을 지속해야 하므로 Mitomycin C에 의한 손상을 받지 않아야 하기 때문입니다. 이렇게 해줌으로써 T cell만 분열하고 Splenocytes는 분열하지 않게 됩니다. 하지만 Mitomycin C를 처리하거나 Irradiation을 했다고 해서 Splenocytes가 바로 죽는 것은 아닙니다. 따라서 Splenocytes에서 다른 Cytokine이 분비될 수 있고, 다른 영향들이 있을 수도 있습니다.
4) TCR transgenic CD4 T cell과 antigen-pulsed splenocytes를 이용한 Culture
앞서 설명한 Splenocytes와 CD4 T cell의 Co-culture는 세포 간의 상호작용이 존재한다는 점에서 조금 더 In vivo를 재현한다고 할 수도 있지만, 결국 T cell 활성화를 유도하는 과정에서 Anti-CD3ε antibody를 사용한다는 부분에서 여전히 많은 부분이 인위적인 시스템입니다. 따라서 실제 T cell이 인식하는 항원(정확히는 펩타이드)을 제시하는 APC에 의해 T cell이 활성화되는 것이 조금 더 In vivo 상황에 가깝습니다. OT-II나 2D2 등의 Transgenic TCR을 보유한 CD4 T cell이 있다면, Splenocytes와 항원을 같이 처리해 줌으로써 Splenocytes(정확히는 그중에 있는 APC)에 의해 제시된 항원을 통해 CD4 T cell을 활성화시킬 수 있습니다. 물론 APC를 분리해 내서 처리해 주는 것도 가능하지만, 실험적인 측면에서 쉽지 않기 때문에 굳이 APC를 분리하지 않고 전체 Splenocytes를 처리해도 그중에 존재하는 APC가 항원을 제시함으로써 T cell을 활성화시킵니다. 물론 실험의 목적이 특정 APC를 연구하는 것이라면 해당 APC만을 분리해서 사용해야 할 것입니다.
4. Th cell polarizing cytokines
T cell이 활성화된 이후에는 T cell의 분화를 결정지을 Cytokine이 필요합니다. 따라서 각 세포가 필요로 하는 Cytokine을 처리해 주면 됩니다 (표 2).
Cytokine만 처리해 줘도 Th cell 분화가 유도되지만, 특정 Cytokine을 중화시킬 수 있는 항체(Anti-IFN-γ, Anti-IL-4)를 처리해 줌으로써 분화율을 높일 수 있습니다. 앞서 설명했듯이 Th1 cell과 Th2분화는 각각 IL-4와 IFN-γ에 의해 저해되기 때문에 Th1 cell 조건에는 Anti-IL-4 antibody를 처리하고 Th2 cell 조건에는 Anti-IFN-γ를 처리함으로써 분화율을 높여줄 수 있습니다. 또한 Th17 cell과 Treg cell의 경우는 Anti-IFN-γ antibody와 Anti-IL-4 antibody를 모두 처리해 줌으로써 분화율을 높일 수 있습니다. IL-2는 Th17 cell의 분화율을 낮추기 때문에 Th17 cell 분화시에는 IL-2를 넣어주지 않습니다(Laurence et al., 2007).
5. T cell 분화에 영향을 주는 요인들
지금까지 T cell 분화에 필요한 요소들을 알아봤습니다 그러나 T cell 분화에 영향을 주는 다양한 요인들이 존재합니다. 그리고 그러한 요인들을 이해할 때 자신이 원하는 목적에 따라 실험 조건을 최적화할 수 있습니다. 따라서 T cell 분화에 영향을 주는 여러 요인들을 소개하도록 하겠습니다.
1) FBS (Fetal bovine serum)
FBS는 세포를 배양할 때 없어서는 안 될 중요한 시약입니다. 일반적으로 Media에 FBS가 10% 포함되도록 섞어서 사용합니다. FBS는 인위적으로 실험실에서 만드는 것이 아니라 동물에서 얻어내는 것이기 때문에 제조 회사가 다르면 FBS를 이루는 성분들에서 차이가 발생합니다. 이뿐 아니라 동일한 회사에서 만든 같은 브랜드 제품이라 할지라도 Lot이 다르면 동일한 FBS라고 말하기 어렵습니다. 놀랍게도 FBS 종류가 달라지면 T cell 분화율이 달라집니다. 예를 들어 Th17 cell이나 Treg cell 분화를 위해 다른 모든 조건을 동일하게 해도 FBS가 달라지면 분화율이 달라집니다 (그림 5). 이러한 이유 때문에 T cell 분화 실험에 사용하는 FBS는 가급적 동일한 제품으로 꾸준히 사용하고 프로젝트 중간에 변경하지 않는 것이 좋습니다.
2) Cell culture media
T cell을 배양하는데 많이 사용하는 Media는 일반적으로 RPMI 1640과 IMDM 두 종류입니다. RPMI 1640의 경우 폭넓게 많이 쓰입니다. 하지만 Th17 cell을 배양하고 분화시키는데만큼은 IMDM을 사용하는 것이 더 효과적입니다. IMDM에는 Aryl hydrocarbon receptor ligand가 있어서 Th17 cell분화를 더 잘 일으킵니다(Veldhoen et al., 2009). 반대로 Th1 cell과 Treg cell의 경우 IMDM보다 RPMI1640에서 분화가 더 잘 일어납니다 (그림 6). 따라서 실험 목적에 맞게 적합한 Media를 사용하는 것이 중요합니다.
3) TCR signal 강도
T cell 분화에 있어서 필수적인 TCR signal의 강도는 T cell 분화를 결정짓는 핵심적인 요소입니다. TCR signal의 강도를 조절함으로써 Th cell 분화 정도를 조절할 수 있습니다. Th17 cell의 경우 TCR signal 강도를 강하게 줄수록 더 높은 비율로 분화가 일어납니다. 반대로 Treg cell의 경우 TCR signal 강도가 작을수록 FOXP3발현이 증가합니다 (그림 7).
4) Cytokine 비율
Th cell 분화 방향을 결정짓는 Cytokine의 양이나 비율이 달라지면 Th cell 분화 정도가 달라집니다. Th17 cell의 경우 IL-6와 함께 TGF-β를 처리하는데, 이때 처리하는 TGF-β는 매우 적은 양으로도 충분합니다. 반면 TGF-β를 전혀 처리하지 않는 경우에는 Th17 cell 분화율이 낮고, 적정량의 TGF-β는 Th17 cell 분화를 최대치로 끌어올리며, 일정 수준을 넘어선 TGF-β는 오히려 Th17 cell 분화를 다시 낮추게 됩니다 (그림 8). 이러한 특징을 잘 이해해서 최적의 비율로 Cytokine을 처리할 때 높은 분화율로 Th cell subset 분화를 유도할 수 있습니다.
6. 마치는 글
지금까지 연구를 통해 배운 지식들과 경험들을 지난 1년 동안 총 10편의 글을 연재하면서 공유했습니다. 많은 분들께서 도움이 되었다는 반응을 보여주셔서 감사하고 보람찬 시간이었습니다. 제 글에 관심을 가져주신 분들께 감사드리고 하시는 연구에서 좋은 성과들을 거두시길 기원하며 글을 마치겠습니다.
* 그림에 사용된 모든 데이터는 연재자가 직접 얻은 데이터입니다.
References
Austyn, J.M., Smith, K.G., and Morris, P.J. (1987). T cell activation by anti-CD3 antibodies: function of Fc receptors on B cell blasts, but not resting B cells, and CD18 on the responding T cells. Eur J Immunol 17, 1329-1335.
Duhen, R., Glatigny, S., Arbelaez, C.A., Blair, T.C., Oukka, M., and Bettelli, E. (2013). Cutting edge: the pathogenicity of IFN-gamma-producing Th17 cells is independent of T-bet. J Immunol 190, 4478-4482.
Laurence, A., Tato, C.M., Davidson, T.S., Kanno, Y., Chen, Z., Yao, Z., Blank, R.B., Meylan, F., Siegel, R., Hennighausen, L., et al. (2007). Interleukin-2 signaling via STAT5 constrains T helper 17 cell generation. Immunity 26, 371-381.
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처음 대학원에서 면역학이란 연구를 시작하던 때를 지금에 와서 돌이켜보면, 그 당시에 누군가가 내게 알려주었다면 연구에 더 많은 도움이 되었겠다고 생각되는 내용들이 있습니다. 이제 막 면역학 연구를 시작하고 있는 석박사생들 및 면역학에 관심을 갖는 학부생들에게 도움이 되고자 면역학 연구에 사용되는 실험 기법 등을 이해하기 쉽게 소개합니다.
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