마우스를 이용한 면역학 연구의 궁극적인 목표는 마우스로부터 얻은 지식을 바탕으로 사람의 면역 시스템을 이해하고 면역 관련 질병들을 치료하는데 있습니다. 그렇기 때문에 사람에게서 나타나는 면역 관련 질병들과 유사한 질병을 마우스 내에서 재현해야 할 필요가 있습니다. 마우스를 이용한 다양한 면역 관련 질병 모델들이 존재하는데, 이번 글에서는 자가면역질활 중 다발성 경화증(Multiple sclerosis)의 마우스 질병 모델인 EAE(Experimental autoimmune encephalomyelitis)에 대한 소개를 하려고 합니다.

 

1. 들어가는 글: 자가면역질환은 무엇인가?

우리 몸의 면역체계가 존재하는 일차적인 목적은 외부에서 우리 몸으로 침투하는 적들(균, 세균, 바이러스 등등)을 인식하고 제거하기 위한 것이라고 말 할 수 있습니다. 하지만 때때로 외부 병원균이 아닌 몸에 있는 조직을 적으로 잘못 인식하고 스스로를 공격하는 면역세포들이 생깁니다. 물론 이런 면역세포들을 억제하는 방법들이 있지만 (Immune tolerance), 다양한 이유로 억제가 풀리고 자신을 공격하는 면역세포들이 활동하게 되는 경우들이 발생합니다. 결과적으로 면역시스템이 자신을 공격함으로 인해 조직 및 기관의 가역적 또는 비가역적 손상이 일어날 수 있으며, 이러한 면역 관련 질병을 자가면역질환이라고 합니다. 류마티스성 관절염, 전신성 홍반 루프스, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 중증근무력증 등등 염증이 발생하여 손상될 수 있는 조직의 종류만큼 다양한 자가면역질환들이 있습니다.

자가면역질환의 종류에 따라 그 원인이 되는 면역세포의 종류에도 조금씩 차이가 있고 기여도도 차이가 있습니다. 하지만 자가면역질환 연구에 대표적으로 사용되는 질병모델들이 존재하며, 그중 하나인 EAE를 소개하도록 하겠습니다.

 

2. Multiple sclerosis VS EAE

신경세포의 Axon은 Myelin이라고 불리는 여러 단백질과 지질로 구성된 층이 감싸고 있으며, Myelin은 신경 신호의 전달 속도를 증가시킴으로써 신경 신호 전달에 있어서 중요한 기능을 하는 구조입니다. 하지만 몸 안의 면역세포들이 신경세포의 Myelin을 구성하는 단백질을 타겟으로 염증반응을 일으키는 경우 Myelin이 파괴되어 (Demyelination) 신경 신호 전달에 문제가 발생하게 됩니다. 이렇게 과도한 면역반응으로 인해 중추신경계에서 Demyelination이 일어남으로써 신경계에 문제가 생기는 자가면역질환이 다발성 경화증(Multiple sclerosis)입니다. 그리고 사람에게서 발생하는 Multiple sclerosis(MS)를 마우스에서 재현한 질병 모델이 바로 EAE입니다. 비록 MS의 기전의 이해 및 치료방법 개발을 위해 EAE를 이용하지만, EAE가 MS를 완벽하게 재현해내지는 않습니다. 질병 모델로서 EAE가 갖는 대표적인 한계점들을 먼저 소개하도록 하겠습니다.

1) EAE는 인위적인 Immunization에 의한 질병이다.

자가면역질환인 MS는 체내에서 다양한 원인들로 인해 Immune tolerance가 깨지고 이로 인해 Myelin을 인식하는 Autoreactive T cell이 활성화되어 발생합니다. 하지만 EAE는 Myelin을 구성하는 단백질 중 하나인 MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein)단백질을 (심지어 전체가 아닌 일부 Peptide) CFA라고하는 강한 Adjuvant와 섞어 Immunization함으로써 인위적으로 MOG를 인식하는 T cell을 활성화시키는 모델입니다. 물론 MS의 경우에도 MOG 단백질이 주요 자가항원으로 작용한다는 부분에서 유사성을 갖지만(Kerlero de Rosbo et al., 1993), EAE에서 사용되는 MOG peptide는 MOG 단백질의 일부일 뿐 아니라 MS에 영향을 줄 수도 있는 MOG 단백질의 Post translational modification도 갖지 않기 때문에 실제 MS의 발병기전에서 MOG 단백질의 역할과 EAE에서 MOG peptide의 역할이 차이가 생길 수 있습니다. 게다가 EAE 모델은 어떻게 Immune tolerance가 깨지는가 보다는 이미 무너진 Immune tolerance 상황에서 어떤 면역세포들이 어떤 방식으로 질병을 유도하는가에 더 초점을 맞춘 연구방법입니다. 이는 대부분의 자가면역질환 모델들이 갖는 한계점이긴 하지만, 이런 이유로 실제 MS의 발병 초기에 어떻게 Immune tolerance가 깨지는지에 대한 연구에는 적합하지 않습니다. 추가적으로 EAE는 실제 MS와는 조금 다른 병리학적 특징들을 나타내게 되는데, 대표적으로 EAE의 경우 MS와는 달리 뇌에 비해 척수(Spinal cord)에 좀더 편향된 염증이 유발됩니다(Lassmann and Bradl, 2017).

2) EAE는 CD4 T cell에 의해 유도되는 질병 모델이다.

EAE가 유도되어 Spinal cord로 면역세포들이 유입되어 신경세포의 Demyelination을 유도하는 과정에는 Dendritic cell, neutrophil, monocyte, CD8 T cell, CD4 T cell, γδ T cell 등등 다양한 면역세포들이 관여합니다. 다양한 면역세포들이 적절하게 영향을 주고받을 때 EAE가 유도되지만, 일반적으로 CD4 T cell의 비중이 매우 크다고 얘기합니다. 앞서 언급한대로 EAE를 유도하는 과정자체가 CFA라는 강한 면역반응을 유도할 수 있는 Adjuvant를 사용하는데, 이런 과정은 MOG peptide를 인식하는 CD4 T cell의 활성을 유도하고 상대적으로 CD8 T cell의 활성은 크게 유도하지 못하기 때문이며, MOG를 인식하는 CD4 T cell의 Adoptive transfer만으로도 EAE가 유도되기 때문입니다. 또한 CD4 T cell이 제대로 기능을 하지 않으면 EAE 유도자체가 되지 않습니다(Carr et al., 2017).

한 가지 극단적인 예를 들자면, MOG_35-55 peptide를 이용한 일반적인 EAE의 경우 B cell이 존재하지 않아도 문제없이 EAE가 유도됩니다(Molnarfi et al., 2013). 하지만 실제로는 B cell과 B cell에 의해 만들어지는 항체가 MS의 발병과정에 연관이 있습니다(von Budingen et al., 2011). 따라서 이 부분만 보더라도 EAE가 완벽하게 MS의 병리학적 특성 및 기전을 재현한다고 할 수 없습니다. 이런 부분을 보완하고자 mouse MOG peptide 35-55를 이용하는 일반적인 EAE와 달리 recombinant human MOG를 이용하거나(Molnarfi et al., 2013) Myelin을 구성하는 또다른 단백질인 PLP를 이용해서(Boyden et al., 2020) B cell-dependent EAE 모델을 개발해 MS에서 B cell의 기능을 연구하기도 합니다.

이러한 한계점이 있음에도 불구하고 EAE는 자가면역질환에 기여하는 면역세포들의 성질 및 MS의 기전 이해에 큰 도움을 주고 있는 것이 사실입니다. 모델이 갖는 한계와 실제 질병과의 유사성을 먼저 이해하고 아는 것이 궁극적으로 질병의 이해 및 치료로 가는 길이기 때문에 EAE가 갖는 특징 및 한계점을 먼저 설명했습니다.

 

3. Active EAE
 

EAE 모델은 크게 Active EAE와 Passive EAE로 구분됩니다. 일반적으로 EAE라고 하면 Active EAE를 의미하는데, 뒤에서 설명할 Passive EAE와 구분짓기 위해 Active EAE라는 명칭을 사용합니다. Active EAE를 유도하기 위해서는 항원으로 사용될 MOG peptide와 CFA가 우선적으로 필요합니다. 항원으로 사용되는 MOG는 전체 단백질이 아닌 MOG peptide 35-55를 주로 사용합니다. CFA는 Complete Freund’s Adjuvant의 약자로 비활성화 또는 건조된 Mycobacteria (M. Tuberculosis)를 포함하는 기름성분이며, 강한 면역반응을 유도하기 위한 Adjuvant로 사용됩니다.

이론적으로는 자가항원에 반응하는 T cell들은 Negative selection에 의해 발생 단계에서 제거가 됩니다. 하지만 이 과정이 결코 완벽하지는 않고, 자가항원을 인식할 수 있는 T cell들이 실제로는 만들어져서 체내에 일부 존재하게 됩니다. 그럼에도 불구하고 이러한 Autoreactive T cell은 여러 경로를 통해 활성이 억제되기 때문에 실제로는 큰 문제를 일으키지 않습니다. 또한 이런 조절 매커니즘은 꽤나 효율적이어서 마우스에 MOG peptide만 주사한다고 해서 MOG peptide를 인식하는 Autoreactive T cell들이 활성화 되지 않습니다. 하지만 강한 염증반응이 유도될 때는 이야기가 달라집니다. 매우 강한 염증반응은 앞서 설명한 조절 메커니즘을 깨고 MOG 단백질을 인식하는 Autoreactive T cell들의 활성을 유도할 수 있습니다. 따라서 강한 면역반응을 유도할 수 있는 Adjuvant가 필요한데, 위에서 언급한 CFA가 해당 목적으로 사용됩니다.

강한 면역반응을 일으킴과 동시에 MOG peptide를 항원으로 제시하여 MOG를 인식하는 T cell의 활성화를 유도함으로써 중추신경계의 Myelin이 파괴되는 과정(Demyelination)을 유도하는 것이 EAE 모델의 기본 원리입니다 (그림 1). 하지만 이 과정이 그렇게 쉽지만은 않습니다. PBS에 MOG peptide를 넣어주고 CFA와 열심히 섞어줌으로써 물과 기름이 섞인 Emulsion을 만들어줘야 하는데, 두 개의 주사기 사이에 압력을 걸어 40분 정도 반복적으로 섞어줘야 하기 때문에 손가락과 손바닥이 꽤 아픈 고된 과정입니다.

추가적으로 Bordetella pertussis라는 박테리아가 만들어내는 Pertussis toxin(PTX)을 주사하는 과정이 필요합니다. PTX의 정확한 기능은 여전히 불분명하지만 Blood brain barrier(BBB)를 약화시키거나(Lu et al., 2008), T cell anergy 유도를 억제하거나(Kamradt et al., 1991) Treg cell의 기능을 약화시킴으로써(Chen et al., 2006) Immune tolerance를 무너뜨리는데 기여하거나, IL-1β생성을 증가시키는 기전(Dumas et al., 2014) 등을 통해 EAE 유도를 촉진시키는 것으로 이해되고 있습니다. PTX는 보통 두 번 (EAE를 유도한 당일과 1~3일 뒤 한 번 더) 주사합니다.

 

4. Passive EAE

앞서 소개한 Active EAE는 MOG peptide를 항원으로 직접 주사함으로써 마우스 안에 존재하는 MOG-specific T cell들의 활성을 유도하는 방법이지만, Passive EAE는 MOG를 인식하는 T cell만을 다른 마우스로 Adoptive transfer함으로써 이식된 T cell에 의해 EAE가 유도되도록 하는 방법입니다. 이러한 방법으로 유도된 EAE는 앞서 소개한 Active EAE와 구분하기 위해 Passive EAE 또는 Adoptive transfer EAE로 불립니다.

Passive EAE는 Th1 cell 또는 pathogenic Th17 (pTh17) cell에 의해 두 가지 방법으로 유도될 수 있습니다. 또한 Th1 cell과 pTh17 cell의 출처에 따라 또다시 크게 두 가지의 방법으로 구분될 수 있습니다. 각 세포의 출처가 어떻게 다르며, 그에 따라 어떤 차이가 있는지 소개하도록 하겠습니다 (그림 2).
 

1) In vitro polarized-MOG-specific T cells

앞서 연재했던 TCR transgenic mouse를 소개하는 글에서 2D2 mouse를 소개했었습니다(Bettelli et al., 2003). 해당 마우스에서 얻는 CD4 T cell은 모두 MOG peptide 35-55를 인식하는 동일한 TCR을 발현합니다. 따라서 2D2 mouse에서 얻은 Naïve CD4 T cell을 Th1 cell 또는 pTh17 cell로 In vitro 분화시킨 후, 해당 세포를 다른 Recipient mouse로 Adoptive transfer해줌으로써 Passive EAE를 유도할 수 있습니다. 2D2 naive CD4 T cell을 Th1 cell 또는 pTh17 cell 분화 조건에서 5일동안 배양하고, 2 X 10⁶ 개정도의 세포를 IV 주사로 Adoptive transfer해주면 성공적으로 EAE가 유도됩니다. Th1 cell을 분화시키기 위해서는 IL-2, IFN-γ, α-IL-4 neutralizing antibody가 사용되며, pTh17 cell을 분화시키기 위해서는 IL-6, IL-1β, IL-23, α-IL-4 neutralizing antibody, α-IFN-γ neutralizing antibody가 사용됩니다.

흥미롭게도 pTh17 cell에 의해 유도된 passive EAE의 경우 일반적인 EAE에서 발견되는 증상과는 조금 다른 증상들이 나오는 Atypical EAE가 유도됩니다(Rangachari and Kuchroo, 2013). 해당 내용에 대해서는 다음 연재글에서 조금 더 다루도록 하겠습니다.

In vitro 분화된 세포들은 실제로 몸 안에서 만들어지는 Th1 cell 또는 pTh17 cell과 차이는 존재할 수 있습니다. 하지만 동일한 조건에서 세포들을 배양할 수 있기 때문에 비교적 일관성 있는 데이터를 얻을 수 있는 장점이 있습니다.

2) Ex vivo expanded-MOG-specific T cells

In vitro culture의 경우 2D2 naïve CD4 T cell을 얻어서 처음부터 pTh17 cell 또는 Th1 cell로 Cell culture dish에서 분화시킨 경우입니다. 하지만 이와 다르게 이미 Active EAE가 유도된 마우스에 존재하는 MOG-specific pTh17 cell 또는 Th1 cell을 이용하는 경우도 있습니다. 이 경우는 이미 체내에서 만들어진 Helper T cell subset의 양을 증식시키는 경우라서 (물론 Polarizing cytokine을 추가하지만) In vitro가 아닌 Ex vivo에 해당합니다.

이 방법으로 MOG-specific T cell을 얻는 과정은 조금 복잡합니다. 먼저 Donor 마우스에 Active EAE를 유도해야합니다. 그러면 자연스럽게 MOG를 인식하는 T cell들이 체내에서 분화 및 증식하게 됩니다. EAE를 유도하고서 7일 뒤에는 Spleen과 Lymph node에서 면역세포 전체를 얻어내고, MOG_35-55 peptide와 Polarizing cytokine을 추가하여 3일정도를 추가적으로 배양하는 과정이 필요합니다. 이 과정에서 Antigen presenting cell에 의해 MOG peptide가 CD4 T cell에게 제시되고, MOG를 인식하는 CD4 T cell들이 선택적으로 증식하게 됩니다. 또한 추가적으로 넣어준 Polarizing cytokine에 의해 Th1 cell 또는 pTh17 cell의 분화가 유도됩니다. 이렇게 MOG를 인식하는 T cell의 숫자를 늘려준 후, CD4 T cell만을 재차 분리해주는 과정이 필요합니다. 이렇게 분리해서 얻은 CD4 T cell을 마찬가지로 Recipient mouse에 Adoptive transfer함으로써 Passive EAE가 유도됩니다. 이 방법의 경우 EAE가 유도된 마우스에서 얻은 CD4 T cell을 Ex vivo 배양을 통해 양을 늘린 경우라서 앞의 In vitro 배양보다는 실제 EAE 과정에서 만들어지는 Helper T cell subset과 더 유사하다는 장점이 있습니다. 하지만 필요한 세포를 얻기까지 꽤 오랜 시간이 필요하며 EAE 유도 및 Ex vivo 세포 배양에서 추가적인 비용이 발생한다는 단점이 있습니다. 또한 In vitro culture의 경우 비교적 순수한 Th1 cell 또는 pTh17 cell subset을 얻을 수 있으나, Ex vivo culture의 경우 다른 T helper cell subset과 분화되지 않은 CD4 T cell이 일부 섞이는 것이 불가피하기 때문에 온전히 Th1 cell 또는 pTh17 cell에 의한 Passive EAE라고 말할 수 없다는 한계점이 존재합니다. 게다가 WT과 특정 유전자가 KO된 세포를 이용해서 비교할 경우 두 그룹간 차이가 Donor 마우스에 존재하는 Th1 cell 또는 pTh17 cell의 비율 자체의 차이와 MOG에 반응하는 T cell의 Clone 차이에 기인할 수도 있다는 점에서 분석에 유의해야합니다.

 

5. EAE 연구를 통해 개발된 치료법: Natalizumab

비록 EAE가 MS를 완벽히 재현할 수는 없지만, EAE를 통해 발견된 면역학적 기전들은 새로운 MS 치료방법들을 제시하는 성과를 가져다 주었습니다. EAE를 통한 연구를 기반으로 개발된 MS 치료법들 중 대표적인 한 가지 경우를 소개하려고 합니다.

Natalizumab은 세포의 이동에 필요한 Integrin의 기능을 억제하는 항체입니다. 구체적으로 Integrin α4β1에 결합하는 단클론항체이며, CD4 T cell이 혈관에서 염증조직으로 이동하는 과정을 저해합니다. 면역세포가 염증이 일어나는 조직으로 이동하기 위해서는 몇가지 일련의 과정들이 필요합니다. 면역세포는 기본적으로 혈액 내에서 순환하고 있습니다. 따라서 특정 위치로 가기위해서는 순환을 멈추고 혈관을 구성하는 Endothelial cell에 부착하는 과정이 선행되어야 하며, 이 과정에서 면역세포가 발현하는 Integrin α4β1이 Endothelial cell일 발현하는 VCAM-1과 결합하게 됩니다(Carman and Springer, 2004). Natalizumab은 이 과정에 필요한 Integrin α4β1이 다른 Ligands와 결합하는 것을 차단함으로써 CD4 T cell이 BBB를 통과하는 것을 막는 역할을 합니다. 이러한 사실은 EAE가 유도된 Rat의 Brain tissue section에 Lymphocyte를 반응시켜 Lymphocyte가 Brain tissue section에 부착되는 In vitro adhesion assay를 이용해 발견되었습니다(Yednock et al., 1992). 여러가지 Anti-integrin antibody중에서 Integrin α4에 결합하는 Antibody를 처리하였을 때 Lymphocyte가 Brain tissue section에 붙는 정도가 감소하는 것을 통해 해당 기전이 발견되었습니다. 이를 기초로 개발된 단클론항체인 Natalizumab은 2004년 미국 FDA의 승인을 얻어 MS 치료에 사용되고 있습니다(Steinman, 2012) (그림 3).

하지만 Natalizumab의 사용이 오히려 면역학적 방어에 필요한 Th1 cell을 감소시킴으로 인해 뇌에서의 JC virus의 기회감염을 일으키고, 결과적으로 Natalizumab을 장기간 사용할 경우 progressive multifocal leukoencephalopathy라는 질병에 취약해지는 부작용도 있습니다(Bloomgren et al., 2012). 또한 MS 발병 및 악화에 기여하는 Th17 cell의 경우 Integrin α4의 발현이 낮고, Natalizumab으로는 Th17 cell의 이동을 효과적으로 막기에는 어렵다는 제한점이 있습니다(Glatigny et al., 2011; Rothhammer et al., 2011; Schneider-Hohendorf et al., 2014).

 

6. 마치는 글

사람에게서 발생하는 면역 관련 질병들을 제대로 이해하고 치료방법을 제시하기 위해서는 실험 동물에서 유사한 질병을 재현하는 것이 필요합니다. 이러한 목적으로 MS 연구에 사용되고 있는 EAE라는 질병 모델에 대해 이론적인 부분을 중심으로 소개했습니다. 다음 연재에서는 EAE를 통해 얻을 수 있는 데이터와 EAE를 이용한 연구를 함에 있어서 필요한 실제적인 팁들을 소개하도록 하겠습니다. 자가면역질환을 연구하고있는 대학원생들이 이번 연재를 통해 EAE라는 질병 모델에 대한 이해가 확장되었기를 바라며 이번 글을 마무리 짓겠습니다.

References

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