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[실험 전에 알면 좋은 것들] 5. sh-RNA를 이용해서 타깃 유전자의 기능을 억제(knockdown)하는 방법 실험 전에 알면 좋은 것들 연재

[실험 전에 알면 좋은 것들] 5. sh-RNA를 이용해서 타깃 유전자의 기능을 억제(knockdown)하는 방법

  • 등록2026.05.18.
  • 조회1388
sh-RNA를 이용해서 타깃 유전자의 기능을 억제(knockdown)하는 방법

바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입(Transduction)은 변수가 많아 트러블슈팅(Troubleshooting)이 까다로운 실험입니다. 이번 연재에서는 sh-RNA (short hairpin RNA)를 이용하여 packaging cell (예, 293T 세포)에서 렌티바이러스(Lentivirus)를 생산하고, 이를 타깃 세포(예, U2OS-DR)에 감염시켜 타깃 유전자의 기능을 억제(knockdown)하는 과정을 소개합니다. 이와 유사한 연재로 “[실전 실험 프로토콜 101] #6. Stable cell line 만들기”와 같이 보면 도움이 됩니다 (출처 1).

그림 1. sh-RNA를 이용해서 타깃 유전자의 기능을 억제하는 방법(제미나이 사용). 1X: 형질도입 1번, 2X: 형질도입 2번.

실험 절차

Day 1. 플레이트(Plate) 코팅
10 cm 플레이트에 0.1% 젤라틴을 코팅하여 293T 세포의 부착력을 높입니다.

Day 2. Packaging 세포(293T) 준비
다음 날(Day 3), 293T 세포의 컨플루언시(Confluency)가 ~80%가 되도록 조절하여 10 cm 플레이트에 분주합니다. (예, 1:3 비율로 split).

Day 3. PEI 트랜스펙션(transfection) (출처 2)
튜브 A: DMEM 990 µl (노트 1) + 플라스미드 DNA mix (총 18 µg, sh-RNA 9 µg, ∆8.9 6.75 µg, VSV-G 2.25 µg)
튜브 B: DMEM 955 µl + PEI 45 µl (DNA:PEI = 1:2.5)
튜브 B를 튜브 A에 섞은 후 상온에서 15분간 인큐베이션(incubation)합니다.
293T 세포의 배지를 제거하고, 새로운 Growth Medium (GM) 4 ml로 교체하고, 최종 CS (Calf Serum)를 10%로 맞추기 위해 추가로 0.2 ml CS를 넣어줍니다.
2 ml의 트랜스펙션 mix를 넣은 후 overnight 배양합니다. (총 6 ml)
타깃 세포(U2OS-DR)용 6 cm 플레이트를 0.1% 젤라틴으로 미리 코팅하여 준비합니다.

Day 4. 배지 교체 및 타깃 세포 분주
트랜스펙션 24시간 후, 293T 배지를 V-GM (Virus growth medium) 6 ml로 교체합니다 (노트 2). 타깃 세포(U2OS-DR)를 젤라틴으로 코팅한 6 cm 플레이트 2개에 분주합니다 (노트 3). 형질도입을 하나의 플레이트에는 1번(1X)을 하고, 또 다른 플레이트에는 형질도입을 2번(2X)을 할 예정입니다. 항생제 선별할 때 사용할 타깃 세포를 별도의 작은 플레이트에 키웁니다(Day 6).

Day 5. 바이러스 수확 및 형질도입

오전에 1차 수확
293T 배지를 수거하여 0.45 µm 필터(Syringe Filter)로 거릅니다(약 5.5 ml). 새로운 V-GM 3 ml을 섞어 총량을 약 8.5 ml로 맞춥니다. Polybrene 최종 농도를 8 µg/ml이 되도록 첨가합니다. 두 개(1X, 2X)의 타깃 세포 플레이트에 약 4 ml씩 처리합니다. 293T 세포에 다시 V-GM 6 ml을 넣어 바이러스의 추가 생산을 유도합니다.

7시간 후, 2차 수확
두 번째 처리할 그룹의 배지를 제거합니다. 293T 배지를 수거하여 필터링한 후 타깃 세포에 3 ml를 넣습니다. 신선한 V-GM 1 ml을 추가하여 최종 4 ml을 맞추고, Polybrene을 넣습니다.

Day 6. 트랜스펙션 72시간 후 배지 교체
형질도입한 그룹을 일반 성장 배지로 교체합니다. 항생제 선택을 위한 대조군(Control) 세포를 준비합니다.

Day 7. 1:2 split
1:2 비율로 split 합니다.

Day 8. 항생제 선별(Selection)
0.7 µg/ml Puromycin (노트 4)을 타깃 세포와 대조군 세포에 처리하여, 형질도입된 세포만 선택적으로 배양합니다.

주요 시약 및 준비물
 
타깃 유전자 기능 억제 확인

Puromycin 선별을 통해 형질도입이 되지 않은 셀은 살지 못합니다. 선별이 끝나면, 웨스턴 블랏(Western Blot)을 이용하여 타깃 유전자 단백질 억제를 확인합니다 (그림 2). 웨스턴 블랏 결과는 sh-Non target은 타깃 유전자 단백질이 발현되고, sh-Target 1과 sh-Target 2 (노트 8)가 포함된 셀에서는 타깃 유전자 단백질 발현이 되지 않습니다.  

그림 2. 웨스턴 블랏을 이용한 타깃 유전자 발현 억제 확인 (출처: 본인)

노트

1. PEI와 DNA를 섞을 때 plain media를 사용합니다.
2. 트랜스펙션 후 배지 교체 때 배지량을 줄여 더 농축된 바이러스 상등액을 얻습니다. (예: 10 cm 플레이트에 10 ml 대신 6 ml)
3. 다음 날, 60% 컨플루언시가 되도록 합니다.
4. 세포에 따라 별도로 실험을 하여 항생제 농도를 결정합니다.
5. 벡터 구성과 LTR (Long Terminal Repeat) 내 반복서열 때문에, 복제 과정에서 genomic rearrangement (DNA 재배열/재조합)이 일어날 수 있습니다. 플라스미드가 재조합 백본으로 바뀌면, 트랜스진/바이러스 게놈 부분이 소실되어, 바이러스 생산에 실패하고, 발현이 안 됩니다. 이를 막기 위해서는 재조합 억제 균주(Stbl2, Stbl3, NEB Stable 등)를 사용하고, 37°C에서 키우지 말고, 30°C에서 키우고, 과배양을 금지하여 재조합 위험을 낮춥니다. 또한 콜로니를 고를 때 작은 콜로니 위주로 여러 개 뽑아 엔자임 컷으로 컨트롤과 비교합니다.
6. V-GM의 HEPES는 바이러스 입자의 안정성을 높여주며, Inactivated FBS는 바이러스 불활성화를 방지합니다.
7. 바이러스와 세포막은 둘 다 음전하라 반발이 생깁니다. Polybrene은 흔히 쓰는 양이온성 시약으로 바이러스와 세포막 사이의 전기적 반발을 줄여 흡착을 늘려 효율을 높여 줍니다.
8. sh-RNA를 이용해서 유전자 억제 실험을 할 때 여러 개의 sh-RNA 서열을 사용해서 실험의 신뢰성을 높입니다(off-target 효과 교차 검증, 억제 효율 차이 확인).

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이번 연재는 연구자와 학생들이 실험 전에 알면 좋은 점들에 관한 내용입니다. 이 연재를 통해 실험 전에 미리 알아두면 도움이 되는 내용들과, 실험을 진행한 후에야 깨닫게 되는 것들을 미리 알아서, 실험하는 데 실수를 줄이는 데 도움이 되고자 합니다. 실험을 하는 사람이라면 모두에게 적용할 수 있는 실전 팁을 소개하겠습니다.
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