방사선, 항암제, 혹은 DNA 복제 스트레스 (Replication Stress)는 세포에 치명적인 손상인 DNA 이중가닥 절단 (Double-Strand Breaks, DSBs)을 일으킵니다. 이 손상이 제대로 복구되지 않으면 세포는 유전체 불안정성, 세포 사멸, 혹은 암 발생으로 이어질 수 있습니다. 이번 연재에서는 이중가닥 절단 복구 과정 중, 복구 경로를 결정짓는 핵심 단계인 DNA 말단 절제 (End Resection)의 개념과 이를 실험적으로 관찰하는 방법을 소개합니다. 

DNA 이중가닥 절단 복구 경로

끊어진 DNA를 복구하기 위해 세포는 크게 비상동 말단 연결 (Non-homologous End Joining, NHEJ)과 상동 재조합 (Homologous Recombination, HR) 경로를 사용합니다. 비상동 말단 연결은 세포주기 전반에서 작동하며, 말단 절제 없이 DNA 끝을 빠르게 연결하지만 오류 발생 가능성이 큽니다. 이에 반해, 상동 재조합은 S기와 G2기에서만 제한적으로 일어나며, 손상 없는 자매 염색분체 (Sister Chromatid)를 주형으로 사용하기 때문에 정확도가 높습니다. 이 과정에서는 정교한 복구를 위해 반드시 말단 절제 과정을 거쳐야 합니다. 

표 1. 비상동 말단 연결 (NHEJ)와 상동 재조합 (HR) 비교

DNA End Resection (말단 절제)

DNA 말단 절제는 상동 재조합의 첫 번째 단계로, 손상된 DNA 말단이 5՛에서 3՛ 방향으로 깎여나가면서,  3՛ 돌출 말단을 가진 긴 단일가닥 DNA (single-stranded DNA, ssDNA)로 전환하는 과정입니다. 이 단일가닥은 RPA (replication protein A) 단백질로 코팅되어 안정화됩니다. 말단 절제가 진행되면 상동 재조합이 촉진되고, 비상동 말단 연결은 억제됩니다. 따라서 말단 절제는 복구 경로 선택의 핵심 단계입니다 [그림 1].

그림 1. 비상동 말단 연결 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) [출처 2]

DNA 말단 절제 분석 방법 [그림 2]

말단 절제 분석법은 주로 DNA 손상 복구 (특히, 이중가닥 절단 복구) 경로를 연구할 때 사용하고, 말단 절제 분석법으로 RPA foci 분석, BrdU 기반 ssDNA 검출, qPCR, DNA fiber assay, NGS 기반 END-seq 등이 있습니다. 고가의 장비 없이 수행 가능한 면역형광기법 (Immunofluorescence) [출처 1]은 2 가지가 있습니다. 하나는 절제된 단일가닥에 결합하는 RPA 단백질을 항체로 검출하는 것이고, 또 다른 하나는 BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine)로 미리 세포의 DNA에 표지한 뒤, DNA가 말단 절제로 인해 단일가닥 상태가 되었을 때만 항체가 BrdU를 인식하여 형광을 띠게 되는 원리를 이용합니다. 이번 연재에서는 RPA foci형성 분석에 대해 설명하겠습니다.

그림 2. DNA 말단 절제 분석 방법 [출처 2]

RPA foci 형성 분석 [그림 2]

RPA는 단일가닥에 결합하는 단백질입니다. End resection으로 단일가닥이 생성이 되면, 이 단일가닥에  RPA가 결합하며, 이를 면역형광염색으로 검출하여 RPA foci 수나 강도를 측정합니다. 

1. 1. 코팅: 6-well 플레이트의 각 웰에 커버슬립 (Coverslips)을 3장씩 넣고 0.1% 젤라틴 용액 2ml를 넣습니다 [노트 1]. 상온에서 2시간 동안 둔 후, 젤라틴 용액을 제거하고, 커버슬립을 공기 중에 완전히 말립니다. (코팅 과정을 생략해도 가능) 
2. 2. 세포 배양: 세포를 희석하여 (예, 1:4) 세포가 잘 붙어서 자라도록 이틀 동안 배양합니다 [노트 1].  
3. 3. 손상 유도: 세포에 방사선 (Ionizing Radiation, IR)을 처리하여 DNA 이중 가닥 절단을 유도합니다. 손상 후 복구 기전이 작동하도록 1시간 동안 배양합니다.  
4. 4. 세척: 배양 배지를 제거하고 차가운 1x PBS로 헹굽니다. 
5. 5. 전추출 (Pre-extraction): 1x PBS를 제거하고, 차가운 전추출 버퍼를 넣습니다 [노트 2]. 
6. 6. 고정 (Fixation): 전추출 버퍼를 제거하고, 2% PFA (Paraformaldehyde)를 넣고 상온에서 20분간 고정합니다 [노트 3]. 
7. 7. 투과 (Permeabilization): 1x PBS로 헹군 뒤, 0.1% Triton X-100을 넣고 상온에서 3분간 처리합니다 [노트 4]. 
8. 8. 블로킹: 비특이적 결합을 막기 위해 블로킹 솔루션으로 상온에서 30분간 처리합니다. 
9. 9. 1차 항체: 커버슬립에 1차 항체 (Anti-RPA, 1:50) 50µl를 넣고 37ºC에서 1시간 처리합니다. 
10. 10. 2차 항체: 1x PBS로 3회 세척하고, 2차 항체 (1:200) 50µl를 넣고 37ºC에서 30분 처리합니다 [노트 5]. 
11. 11. 마운팅: 1x PBS로 3회 세척하고, 유리 슬라이드 위에 DAPI (핵 DNA 염색용) 10µl 넣고, 그 위에다가 커버슬립을 뒤집어서 올립니다 [노트 6]. 투명 매니큐어로 커버슬립 주위를 봉인합니다. 커버슬립 슬라이드를 빛이 들어오지 않는 상자에 넣고 -21ºC에 보관합니다 [출처 1]. 

표 2. RPA foci 분석 단계 요약

노트

1. 1. 전추출 과정에서 세포가 슬라이드에서 떨어져 나가는 것을 방지하기 위해 젤라틴 코팅을 하고, 이틀 동안 배양합니다. 젤라틴 코팅은 생략해도 되고, 젤라틴 코팅보다 세포를 이틀 동안 배양하는 것이 세포 고정에 더 중요했습니다.
2. 2. 고정 (Fixation) 전에, 결합력이 약한 비특이적 단백질을 씻어냅니다. 이 과정이 없으면 세포 전체에 퍼져 있는 수용성 RPA까지 모두 고정되어 형광으로 빛납니다.  
3. 3. PFA는 세포 속의 단백질 아미노기 (-NH2)와 반응하여 공유결합을 형성하고, 세포의 구조를 고정합니다. 
4. 4. Triton X-100은 세포막의 지질을 제거하여 항체가 핵 내부로 들어갈 수 있게 합니다. 일반적으로는 0.1%를 많이 사용하고, 핵 단백질 염색을 강하게 할 때는 0.2-0.5%를 사용합니다.
5. 5. 형광 물질은 빛에 약하므로 2차 항체 처리 단계부터는 빛을 차단합니다.  
6. 6. DAPI는 DNA의 A-T rich sequence에 강하게 결합은 형광 염료로, 핵의 위치와 형태를 파란색으로 시각화합니다. 

출처