1. 1. 들어가며
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3. 통계는 조금… 아니, 많이 어렵습니다. 중학교, 고등학교, 그리고 대학교 시절에도 통계를 배웠지만 실제로 통계를 돌려보고 이게 정답인지 확신하는 것은 여전히 어렵습니다. 사실 이 글도 제가 완전히 확신을 하고 쓰는 글은 아닙니다. 어딘가 오류가 있을 것 같은 두려움이 듭니다. 

그래도 의지할 곳이 하나 있습니다. 바로 그래프패드(Graphpad)입니다. 그래프패드는 유료 프로그램이라 이 프로그램의 사용을 제가 권장하는 것이 맞나 싶기는 합니다(학생과 포닥은 1년에 142달러이고, 한 컴퓨터에서만 사용할 수 있습니다. 올해 4월 기준 약 19만 원 정도였네요). 그런데 분명히 그 값어치를 합니다. 그렇기 때문에 본 글에서는 그래프패드를 어떻게 활용할 수 있는지 설명드리고자 합니다

1. 2. Student’s t-test

아마도 가장 많이 쓰는 통계적 방법은 두 그룹을 비교하는 Student’s t-test입니다 (Student는 학생이라는 뜻이 아니라 사람의 이름, 정확히는 William Sealy Gosset의 필명입니다. 따라서 대문자로 쓰셔야 하고, 소유격인 ‘s를 붙이셔야 합니다).
T-test를 하려면 Column 🡺 Create를 하시면 됩니다.  

데이터를 넣은 후 위에 있는 “Analyze” 버튼을 누르면 여러 통계를 수행할 수 있습니다.  

“t tests”를 클릭합니다.  

1. 2.1. Unpaired, parametric test
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3. 가장 많이 하는 통계적 검정법은 ‘그룹 간 비교’, 즉 Unpaired test입니다. 그리고 거의 대부분 데이터는 Gaussian distribution (정규분포)를 따르기 때문에 parametric test (모수 검정)를 수행하겠습니다. 마지막으로 일반적인 실험에서는 두 집단의 표본 크기가 비슷하고 이상치가 적거나 없기 때문에 두 그룹 간 표준 편차가 같다고 가정(등분산 가정)하고 분석을 수행하겠습니다.  

실험군과 대조군을 비교하면 p value 0.0213이 나왔습니다. P value 0.05를 기준으로 본다면 두 그룹이 통계적으로 유의미한 차이를 보이네요.

그래프를 만들어 보겠습니다. 왼쪽에 있는 Graph를 클릭하면 여러 형태의 그래프가 나오고, 저는 그중에서 bar graph를 선택했습니다. 그리고 위에 보이는 Click to add or format pairwise comparisons. 버튼을 클릭하면 꺾쇠가 생성되고 별표가 찍힙니다. 

과거 Graphpad 버전에는 없던 기능인데 언제부터 인지 새로 생겨서 정말 유용하게 쓰고 있습니다. 제가 다른 사람들에게 Graphpad를 구매하라고 하는 이유 중에 굉장히 큰 이유입니다 (그래프패드 너무 비쌉니다…ㅠ). 

1. 2.2. Non-parametric test (정규분포 아닐 때, 비모수 검정)
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3. 만약 사람 시료를 다뤄서 샘플 수가 많고, 표본 크기가 다르며, 정규 분포를 보이지 않는 샘플이라면 어떻게 해야 할까요? 먼저 샘플이 정규 분포를 보이는지 아닌지를 아는 것이 중요합니다. 이를 위해서 정규성 테스트를 수행하겠습니다. 

아래쪽에 Normality and Lognormality Test라는 항목이 있습니다. 이를 클릭합니다.  

여러 테스트들을 고를 수 있는데, 저는 아래 그림과 같이 기본으로 세팅된 테스트를 선택하겠습니다.  

일반적으로 실험을 하는 표본 숫자는 너무 적어서 정규성 분포를 벗어나기가 어렵습니다. 이 테스트는 샘플이 많을 때 (n> 30) 수행해 보세요. 그리고 사람 데이터(예: GTEx)라면 꼭 수행하는 것이 좋습니다.  

아무튼 본 정규성 테스트에서 normality test를 통과하지 않는다면, 즉 정규분포를 이루지 않는다면 아래와 같은 결과가 보일 것입니다. 

정규분포를 이루지 않을 땐 비모수 검정(non-parametric test)을 수행해야 합니다. 검정법 중 하나인 Mann-Whitney test는 숫자 값을 분석하는 것이 아니라 순위로 변환한 후, 그 순위의 분포가 유의미하게 다른지 검정해 줍니다.  

1. 2.3. Paired t-test
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3. 만약 데이터가 약물 처리의 전/후를 비교하거나, 같은 생쥐의 왼쪽-오른쪽을 비교하는 등, 짝지어서 데이터를 분석해야 할 때가 있습니다. 이 때는 Paired t-test를 수행하면 됩니다.  

1. 3. One-way ANOVA
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3. 비교해야 할 군이 3개 이상이 되면 t-test가 아니라 ANOVA (Analysis of variance, 분산 분석)를 수행해야 합니다. 아래 예시에서 Analyze를 누른 후 One-way ANOVA (and ~)을 선택합니다.  
   
   
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이제부터는 그림에 나오는 설명을 바탕으로 분석법을 택하시면 됩니다. 그룹 간 비교이기에 matching 하지 않고, 가우스 분포를 나타내고, 표준편차가 같다고 가정하겠습니다.  

Multiple Comparisons 탭으로 들어가서 2번째인 모든 컬럼을 다른 모든 컬럼과 비교를 선택합니다.  
Options 탭에서 추천하는 Tukey test를 수행하고 OK를 누릅니다.  

통계 탭의 Multiple comparisons 세 조건 간의 비교가 나옵니다. 세 조건 모두 p value가 0.05 미만으로 나오네요.  

이 그래프도 위와 마찬가지로 Draw 밑 버튼을 클릭하면 자동적으로 꺾쇠가 생성됩니다. 참으로 많이 편리해졌습니다.  

1. 4. Two-way ANOVA
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3. 4.1. Ordinary two-way ANOVA
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5. 만약 실험 조건이 2가지라면, 예컨대 genotype x diet, genotype x treatment와 같이 2가지 조건이 복합적으로 실험에 이용되었다면 Two-way ANOVA를 수행해야 합니다. 또한 같은 개체를 반복 측정한 데이터, 예컨대 몸무게나 혈당, 암의 크기를 반복 측정한 시계열 데이터도 Two-way ANOVA로 분석해야 합니다. 

Two-way ANOVA는 grouped를 선택하여 분석을 시작합니다. 실험에 수행한 반복 시료 수를 입력하고 create를 눌러줍니다.  

예를 들어 WT과 KO에서 Treatment 유무에 의해 다음과 같은 결과 값을 얻었다고 가정하겠습니다. 그리고 Analyze 버튼을 누르면 Two-way ANOVA를 선택할 수 있습니다.  
Model 탭은 한 개체를 반복해서 측정(repeated measures)한 것이 아니면 이대로 진행시키면 됩니다. 

쭉 건너뛰어서 Multiple Comparisons로 옵니다. 
이번에 Graphpad가 버전 10으로 업그레이드되면서 새로운 통계적 기법을 도입했습니다. Compare cell means with others in its row and its column입니다. 그림에서 보다시피 각 그룹의 평균을 다른 그룹과 비교하는데, 그 비교군이 WT vs KO (in Veh), WT vs KO (in Treatment) 이런 형태입니다. 아마도 저를 포함해서 가장 많은 실험자들이 비교하고 싶은 그룹 간 비교일 것입니다. 제가 통계를 돌려보니 이전 버전보다 직관에 가까워졌습니다. 분명히 그래프 상으로는 차이가 나는데, 통계적으로는 유의미하지 않다고 나오던 값들이 이제는 통계적으로 유의미하게 나옵니다. 어떤 통계적 기법과 수식을 사용했는지는 모르겠지만, 확실히 예전보다 나아졌다는 생각이 듭니다. 

Two-way ANOVA 결과 창입니다. Row factor는 열(veh vs treatment) 요소가 total variation에 미치는 영향이고, column factor는 행(WT vs KO) 요소가 total variation에 미치는 영향과 유의미함을 나타냅니다. 두 요소 모두 데이터에 유의미한 차이를 야기했다고 볼 수 있습니다.  

이번 업데이트로 가장 달라진 화면인 Multiple comparisons입니다. 직관적으로 어떤 요소들이 통계적으로 다른지 확실히 보여줍니다. 더 설명할 필요가 없을 것 같습니다.  

그래프로도 잘 표현됩니다.  

1. 4.2. Repeated Measures (반복 측정)
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3. 한 개체를 시간에 따라 반복 측정해야 할 일이 있습니다. 이때 사용하는 통계적 기법이 two-way ANOVA의 일종인 repeated measures ANOVA입니다. 아래 예시는 제 데이터에 숫자를 임의로 좀 바꾸어서 만들어본 데이터입니다. 맨 왼쪽 0 ~ 6은 반복 측정한 시간이고, 그 옆 숫자들은 개체들의 어떤 측정값입니다.  
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Analyzed 🡺 Two-way ANOVA를 클릭해서 들어오면 친절하게 잘 설명이 되어 있습니다. 제가 데이터를 어떤 형태로 넣었는지 그림을 참고하여 선택하고, 나머지는 선택지는 기본 값으로 둔 채 Repeated Measures 탭으로 넘어가겠습니다.  

이전 그래프패드 버전에서는 결측치가 하나라도 있으면 repeated measures ANOVA가 불가능했습니다. 어느 버전 (8인지 9인지 모르겠습니다만…)부터 결측치가 있어도 이 통계 분석이 가능해졌습니다. 결측치가 없으면 일반 repeated measures ANOVA, 있으면 mixed-effects model을 통해 결측치를 메웁니다. 그리고 알아서 결정하도록 하는 It depends 버튼을 누르겠습니다. 나머지는 기본 설정 그대로 가겠습니다.  

이번 버전에서 업데이트된 Compare cell means with others in its row and its column을 선택하였습니다. 이 검정법은 확실히 그래프를 봤을 때 느껴지는 직관과 통계 검정 값을 비슷하게 만드는 장점이 있습니다(차이가 나는 것을 차이 나게, 차이가 나지 않는 것을 나지 않게).  

통계 탭에서 ANOVA 분석값과 각 시간에서 WT과 KO의 차이를 보여줍니다(Tukey가 recommended 방법인데 왜 Sidak으로 되어있는지 모르겠습니다. 다음부터는 Tukey로 바꾸겠습니다.).  

그래프는 summary data 탭으로 가신 후에 점선으로 이어진 그래프를 선택하시면 됩니다.  

이 그래프에서는 자동 p value 체크가 적용되지는 않습니다. 다음 버전에서는 되면 더 좋겠습니다.

참고로 그래프패드 버전 9에서는 시간 5와 6에서 WT과 KO의 차이가 유의미하지 않다고 판정해 주었습니다. 분명 그래프 상으로는 차이가 있어 보이는데 말이죠. 이번 그래프패드 버전 10에서는 시간 5와 6에서 유의미한 차이가 있다고 말해줍니다. 어떤 마법을 부렸는지는 모르겠지만 그래프패드 관계자분들께 감사드립니다. 

1. 5. Heatmap 그리기
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3. Heatmap은 통계적 기법은 아닌데, 이 그래프를 그리기 어려워하시는 분들이 있어서 간단히 소개만 드리겠습니다. Heatmap은 그래프패드 튜토리얼에서는 Grouped로 되어 있습니다. 하지만 Grouped에서 heatmap을 그리면 group의 평균값으로만 heatmap이 그려집니다. 아마도 많은 분들이 원하는 heatmap 모양은 각 시료마다 heatmap 색이 나오는 것일 겁니다. 그럴 때는 Column에서 값을 넣으신 후 그래프 탭에서 Grouped로 이동하셔서 Heatmap을 (강제로) 그리시면 됩니다. 그리고 색을 적당히 칠하시면 끝납니다.
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5. 6. 나가며
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7. 제가 논문에서 사용한 그래프 그리는 법은 volcano plot과 linear regression (선형 회귀)만 제외하고 다 설명했습니다. Volcano plot은 거창한 것이 아니라 엑셀에서 log2 fold change와 p value를 계산한 후에, X-Y 축 그래프로 그리시면 됩니다. Linear regression도 엑셀에서 추세선 그리는 방식으로 충분히 하실 수 있습니다. 물론 그래프패드에서 가능합니다만 (통계에서 linear regression 또는 correlation을 검색하시면 됩니다) 통계량 자체는 엑셀에서도 충분히 구하실 수 있어서 생략하였습니다. 

통계는 어렵고도 어렵습니다. 이 글을 다 쓰고 나서도 여러 번 검토하면서 혹시 틀린 점이 있나 찾아봤지만, 아마도 틀린 것이 남아있을 것입니다. 틀린 내용을 발견하신다면 너그럽게 이해해 주시고 저에게 꼭 말씀해 주세요. 저도 더 성장하겠습니다. 그래도 우리의 통계 동료, 그래프패드가 있어서 저는 든든합니다. 이 친구 없었다면 요즘에 저널에서 요구하는 시료 값을 점으로 찍는 것도 불가능했을 겁니다. 통계 때문에 스트레스받는 것은 당연할 것이고요. 그래프패드 회사에 매년 20만 원 가까이 지불하는 것이 가끔은 마음이 아프지만, 그래도 많은 것들을 대신해 주니 감사하게 생각하고 있습니다. (다만 바라는 것은 조금 가격을 내려줬으면 하는 것, 아니면 학교 전체에 제공할 수 있도록 계약을 해주는 것, 아니면 학교나 과 차원에서 제공해 주는 것… 아닙니다. 감사히 잘 쓰겠습니다…).