1. 1. 들어가며
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3. 앞선 글에서 GWAS 데이터포털인 CMDKP, T2DP 및 Genebass를 소개해드렸습니다. 본 글은 이 포털 이외에 제가 사용하거나 알고 있는 여러 데이터 포털 중 Human Protein Atlas와 GTEx를 상세히 소개해드리고자, 나머지 데이터베이스도 간단히 언급하고자 합니다.
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5. 2. Human Protein Atlas (HPA): https://www.proteinatlas.org/
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7. 제가 어떤 유전자에 대해 공부하겠다는 마음이 들었을 때 가장 먼저 들어가 보는 사이트입니다. 처음에는 사람에서 특정 유전자의 조직별 발현량과 세포 내 위치 정보(안티바디 기반)를 알려주는 사이트로 유명했는데, 이제는 정말 여러 유용한 정보를 제공하는 정보 포털로 자리매김했다고 생각합니다. 저는 무엇보다 Human Protein Atlas가 꾸준히 데이터셋과 기능을 업데이트하는 것이 가장 마음에 듭니다. 업데이트를 통해 제가 이전부터 잘 써왔던 GTEx (Gene Expression Portal), Alphafold, STRING, TCGA (The Cancer Genome Atlas) 등의 데이터베이스까지 부분적으로 연동시켜 놓았기 때문에 해당 사이트를 일일이 들어가서 검색해야 하는 수고까지 덜어주었죠. 이 사이트에서 어떤 것들을 할 수 있는지 살펴보겠습니다.  

1. 2.1. Summary
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3. 예시 유전자로 SREBF1(SREBP1의 gene symbol)을 검색해 보겠습니다. 검색을 하고 유전자를 클릭하면 Human Protein Atlas에서 제공하는 다양한 데이터들의 Summary가 나옵니다. 사실 이 정보만으로도 충분할 때가 많습니다. 앞으로 상술할 데이터 외에도 UniProt과 Entrez에서 제공하는 gene function 정보도 제공하기에 이 정보를 알기 위해 NCBI나 GeneCard 등의 홈페이지를 참조하지 않아도 됩니다.
   
   
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6. 2.2. Tissue
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8. Tissue 탭은 제가 가장 많이 사용하는 탭으로 조직 별 유전자의 발현량을 보여줍니다. RNA expression은 5명의 사람 샘플을 분석하여 자체적으로 생산한 RNA-seq과 가장 많은 사람 조직 데이터를 보유하고 있는 GTEx를 병합한 값을 제공합니다. 아무래도 Human Protein Atlas에서 분석한 시료 수가 적기 때문에 저는 GTEx data를 먼저 살펴보는 편입니다. GTEx data는 SREBF1이 Adrenal gland, liver에서 발현이 높고, adipose tissue에서도 상당량이 발현됨을 보여줍니다. 

Protein expression은 모든 조직의 slide를 항체로 염색한 후 항체 염색 정도에 따라 high, middle, low로 구분하였습니다. 사람이 임의대로 구분한 데이터라서 이 데이터를 자체를 그대로 인용하기보다, 필요 시에 각 슬라이드를 직접 살펴보면서 항체 염색 패턴을 살펴봅니다.  

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   2.3. Subcell
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3. 순서를 건너뛰고 특정 단백질의 세포 내 위치 정보를 보여주는 subcellular location으로 왔습니다. 제 생각에 Human protein atlas에서 가장 신뢰도가 높고 가장 가치 있는 데이터라고 생각합니다. Human Protein Atlas는 SREBF1가 nucleoplasm, Golgi apparatus 및 cytosol에 존재한다고 제안합니다. 이는 SREBF1이 핵과 ER, Golgi에 위치한다는 여러 연구들의 결과와 일치합니다.  
   
   

아래쪽에 세포 염색 사진을 클릭하면 확대된 사진을 볼 수 있습니다. 기본 마커로 nucleus, microtubule과 ER을 염색해서 보여줍니다. 이 마커들과 target protein (e.g. SREBF1)을 on/off 하면서 세포 내 위치를 특정 면밀하게 살펴볼 수 있습니다. 실험자 본인이 연구를 하기 전 충분히 좋은 참고자료가 될 수 있다고 생각합니다.
저는 제가 실험을 직접 하기 전에 Human Protein Atlas 데이터와 GeneCards 데이터를 참고하여 특정 단백질의 세포 내 위치를 대략적으로 조사하는 편입니다 (출처: https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SREBF1&keywords=srebf1). 

1. 2.3. (Protein) Structure 
   
   

Human Protein Atlas의 장점은 Alphafold version 2 데이터와 함께 known antigen sequences, transmembrane regions 및 InterPro domains을 병합하여 단백질 구조의 특성을 보여준다는 점입니다.  

위에서부터 차례대로

1) Antibody 인식 서열(epitope)

2) 다른 단백질과의 구조 유사성 (자주 관찰되는 중요한 단백질 도메인). 10개 또는 50개 아미노산 단위에서 분석한 각각의 데이터를 보여줌

3) Transmembrane domain

4) Protein domain (LC: low complex, IP: InterPro)

5) Alphafold version 2. Confidence level로도 보여주지만, 제가 domain을 선택할 수 있습니다. 예를 들어 IP-reg. 에서 300 ~ 400 a.a 막대(bHLH-Zip으로 잘 알려진 도메인)를 클릭하면 alphafold가 데이터 위에 highlight 해줍니다. 이 기능은 alphafold 홈페이지에서도 제공되지 않는 기능인 것 같습니다 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/P36956). 이 기능을 잘 활용하면 더 풍요로운 연구를 할 수 있을 것 같아서 더 공부를 해볼 생각입니다.

1. 2.5. Brain
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3. 저는 brain은 잘 알지 못해서 이 탭을 누를 일이 없었는데, 이번에 눌러보니 정말 다양한 데이터를 제공하더군요. Human Protein Atlas에서 brain 영역을 엄청나게 상세히 분리해서 RNA-seq을 수행한 데이터를 제공하는 것을 보고 깜짝 놀랐습니다. 더 나아가 brain proteome 도 제작 중이어서 향후 brain 연구자들에게 많은 도움이 되지 않을까 싶습니다. 이외에도 GTEx, FANTOM5 RNA-seq 데이터를 제공하고, 자체적으로 생산한 pig와 mouse RNA-seq까지 함께 제공하고 있어 Human Protein Atlas가 brain에 얼마나 진심인지를 이번에 알게 되었습니다.  

1. 
   2.6. Single Cell 
   
   

여러 조직에서 수행한 Single cell RNA-seq 정보를 제공합니다. 다만 아쉬운 것은 scRNA-seq의 데이터 출처나 curation, quality control이 다른 데이터들에 비해 잘 되어 있는 것 같지는 않습니다. 본 데이터를 참고할 수 있지만, 특정 유전자가 어느 세포 유형에서 많이 발현하는지를 보려면 이전 글에서 소개한 single cell portal이나 tabula sapiens에서 검색하시는 것이 좋지 않을까 싶습니다. 

1. 2.7. Tissue Cell 
   
   

세포 유형을 대표하는 유전자와의 correlation을 기반으로 어느 세포 유형에서 발현하는지를 추론한 결과를 보여줍니다. 사실 설명을 열심히 읽었지만 무슨 말인지 잘 모르겠습니다… 이 탭도 single cell RNA-seq 결과들이 더 많이 분석된다면 보다 의미 있는 데이터가 되지 않을까 기대합니다. 

1. 2.8. Pathology (Cancer, TCGA) 
   
   

TCGA 데이터를 불러와서 분석한 데이터를 보여줍니다. 통계적으로 유의미한 암을 대상으로 생존 함수에 대표적인 Kaplan-Meier curve를 그려서 보여줍니다. 보라색(핑크색)은 SREBF1을 높게 발현하는 암환자, 파란색은 SREBF1을 낮게 발현하는 환자의 생존 곡선입니다. TCGA 결과는 SREBF1은 endometrial cancer와 pancreatic cancer에서 보다 우호적인(favorable) 유전자로 판단, 즉 SREBF1을 높게 발현하면 보다 오래 생존하는 것을 보여줍니다. 다른 암 종에서 SREBF1의 발현을 보고 싶다면 아래 그림과 같이 CANCER 옆 목록 버튼을 누르면 됩니다. 

1. 2.9. Disease 
   
   
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Disease는 12가지 암종 환자의 혈액 샘플에서 단백질 양을 조사한 데이터를 보여줍니다. 분비되는 단백질 1463가지를 조사하였고, 그중 83개의 단백질이 특정 암 환자 혈액에서 특이적으로 높은, 즉 암 진단 마커로 사용될 후보 단백질로 예측됩니다.  

1. 2.10. Blood
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3. 분비된다고 알려진 단백질들이 ELISA나 PEA (proximity extension assay)로 조사한 결과 및 mass spectrometry에서 검출된 데이터들을 제공하는 탭입니다. 저도 최근에 제가 새롭게 연구하고 있는 분비단백질이 혈액에 얼마만큼 존재하는지 궁금해서 찾아본 적이 있습니다. 생각보다 충분히 검출되는 것을 보고 제 연구 방향이 틀린 것은 아닌 것 같아 내심 기뻤던 적이 있습니다. 저도 이 데이터셋을 어떻게 활용해야 할지는 고민이 됩니다만 향후 업데이트가 이뤄질 것 같아서 꾸준히 지켜볼 생각입니다.  
   
   

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   3. GTEx (Genotype Tissue Expression)
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3. GTEx portal은 이름에서 시사하는 바처럼 사람의 genotype, 즉 SNP와 tissue 내 특정 유전자의 발현량을 보여주는 사이트입니다. 즉 유전자의 발현 정도에 영향을 미치는 염기서열 변이체가 포함된 게놈 영역이란 뜻의 eQTL (expression quantitative trait loci)을 조사하는 목적으로 만들어진 포털입니다. 이를 위해 사람 샘플에서 DNA 서열뿐 아니라 거의 모든 조직에서 수행한 bulk RNA-seq 데이터와 최근에 수행된 snRNA-seq 데이터가 올라와 있습니다. 
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5. 3.1. 조직 별 또는 세포 별 유전자 발현
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7. 예시로 SREBF1을 검색하면 다음과 같이 조직 별 SREBF1의 발현도를 보여줍니다.  
   
   
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10. 더불어 snRNA-seq pilot 결과도 보여줍니다. 본 데이터를 활용한 연구도 논문으로도 나와있으니 참고하시면 좋을 것 같습니다 (출처: https://doi.org/10.1126/science.abl4290). 제 개인적으로는 adipose tissue가 포함이 되지 않아서 많이 들여보지는 않았습니다만, 향후 적극적으로 활용할 계획을 가지고 있습니다.  
    
    

1. 3.2. eQTL
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GTEx의 데이터의 정수인 eQTL 정보입니다. 어떤 SNP가 SREBF1의 발현량을 어느 조직에서 변화시킬 수 있는지를 보여주는 데이터입니다. Search에 조직을 검색하면 되고, 보이는 화면은 eQTL violin plot을 클릭한 것입니다. 이러한 eQTL 정보를 앞서 소개한 T2Dgenetic와 함께 분석하면 더 좋지 않을까 싶어서 열심히 공부를 한 적 있습니다. 하지만 제 공부가 모자라서 이 정보를 어떻게 적극적으로 활용을 할 수 있는지, 어떻게 활용하는 것이 맞는 것인지 몰라서 추후 공부할 영역으로 남겨둔 상황입니다. 혹시 잘 알고 계신 분이 있다면 저에게 꼭 알려주세요…. 미리 고맙습니다. 

eQTL 이외에도 sQTL (splicing quantitative trait loci), ieQTL, isQTL 등의 데이터들이 제공된다고 합니다. 사용법을 잘 알고 계신 분이 있다면 댓글로 꼭 남겨주세요… 

1. 3.3. RNA-seq data download
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3. 제가 GTEx를 사용하는 방법은 크게 2가지입니다.
   - 특정 유전자의 조직 별 발현량 (tissue distribution)
   - 유전자 A와 유전자 B의 발현 상관관계
   이를 위해서는 bulk RNA-seq 데이터 전체를 다운받아야 할 필요성이 있습니다. 현재 GTEx bulk RNA-seq 버전이 8 (snRNA-seq이 v9)이라서 이 데이터를 다운받겠습니다. RNA-seq 데이터를 포함한 다운로드는 https://gtexportal.org/home/datasets 이곳에서 하실 수 있습니다. 
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5. 3.3.1. snRNA-seq data 
   
   
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   h5ad 파일 형식입니다. H5ad 파일을 Seurat으로 바꾸는 방법은 https://mojaveazure.github.io/seurat-disk/articles/convert-anndata.html를 참고해 주세요.
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   3.3.2. 샘플 정보
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9. 샘플 정보는 아래 박스에 보이는 GTEx_v8_Annotations_SampleAttributesDS.txt (조직 및 샘플 정보) 및 GTEx_Analysis_v8_Annotations_SubjectPhenotypesDS.txt (연령대 및 성별 정보)입니다.
    
   위 링크를 클릭하면 아래와 같은 텍스트가 나올 것입니다. 로딩이 끝나는 것을 기다렸다가 Ctrl + A 🡺 Ctrl + C를 통해 전체 복사를 해주세요. 텍스트 파일이니 텍스트를 여는 메모장을 열어주세요.
   
   

메모장에 복사한 내용을 붙여 넣으면 데이터 정렬이 예뻐진 것을 보실 수 있습니다.

이를 다시 전체 선택 🡺 복사 🡺 엑셀에 붙여넣기를 하시면 아래와 같은 샘플 데이터를 얻으실 수 있습니다.  

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3. 3.3.3. Bulk RNA-seq data 다운로드
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5. 조직 별 유전자 발현 중앙값, 즉 median 값에 대한 tissue distribution 만 보실 것이라면 세 번째 파일인 gene_median_tpm.gct.gz (파일 크기: 6.7M)파일만 다운받으시면 됩니다. Gz 파일이니 압축을 푸시고, gct 파일은 엑셀에서 열리니 엑셀에서 데이터를 열람하시면 됩니다. 

샘플 별 RNA-seq 데이터 시료 수는 17382개이고, gene_tpm.gct.gz 파일은 크기가 1.6G, 압축을 풀면 4G가 되는 파일입니다.  

엑셀에서는 열리지 않고 다른 프로그램을 사용해야 합니다. 저는 R을 이용해서 이 파일을 정리하고, tissue 별로 모았습니다. Tissue 별 GTEx RNA-seq 파일을 구글 드라이브에 올렸으니 많이 활용해 주시면 좋을 것 같습니다.(링크: https://drive.google.com/drive/folders/1FHYQbposG3PFJeE4OwXZ4Nu5fix2PSeK?usp=sharing)

1. 4. Post-translation modification (PTM)
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PTM public site들을 모은 논문을 참고하시길 바랍니다 (출처: https://doi.org/10.1093/database/baab012). 

제가 참고해 온 사이트는 아래와 같습니다.
- PhosphoSitePlus: https://www.phosphosite.org/homeAction
- dbPTM: https://doi.org/10.1093/nar/gkab1017 (논문: https://doi.org/10.1093/nar/gkab1017)
- BioGrid: https://thebiogrid.org/ 
- PhosphoNet: http://www.phosphonet.ca/ 

5. 나가며 

옛날에 public data를 사용할 때는 참 편하게 데이터를 뽑는다고 생각했었습니다. 그게 착각이라는 것은 곧 알게 되었습니다. 다른 사람의 데이터를 제 연구에 의미 있게 사용하는 것은 제가 실험하는 것보다 훨씬 어렵고 힘든 일인 것 같습니다. 제 가설을 검증하는 실험도 아닐뿐더러, 사람 데이터는 편차도 워낙 크기 때문입니다. 그럼에도 불구하고 계속 조사를 하는 것은 제 연구 방향이 여러 측면에서 검증되고, 또 사람 데이터에서 충분히 의미를 지니기를 희망하기 때문입니다. 한동안 public dataset을 잘 들어가 보지 않았는데 이제 다시 열심히 들여다봐야겠네요.