[실전 실험 프로토콜 101] #20. MBP 퓨전 단백질 시스템을 이용한 결합 단백질 찾기

Bio통신원(세오(필명))

등록일 2023.09.22
조회 1194

타깃 단백질의 기능 중 타깃 단백질의 특정 지역에 어떤 단백질이 결합하여, 타깃 단백질의 특정 기능을 조절하는 타깃 결합 단백질을 찾는 방법에 대해 알아보겠습니다. 타깃 단백질의 특정 지역을 pMAL 벡터의 maltose-binding protein (MBP) 다운 스트림에 넣어서 MBP 퓨전 발현 벡터를 만듭니다 (노트 1, 출처 1). 이 발현 벡터를 박테리아에 넣어서 MBP 퓨전 단백질을 발현시킵니다. 퓨전 단백질의 발현을 확인한 다음, 이 과발현 단백질을 Amylose resin과 인큐베이션 (incubation)해서 발현 단백질만 따로 추출합니다 (노트 2). MBP 퓨전 단백질의 컨트롤로 MBP만 들어있는 단백질을 추출합니다.

MBP 퓨전 단백질과 별도로 HeLa 셀을 키웁니다. HeLa 셀에서 추출한 단백질과 위에서 추출한 MBP 퓨전 단백질과 인큐베이션합니다 (노트 3). MBP 퓨전 단백질과 결합한 단백질 (HeLa 셀)을 추출합니다. 이 추출한 단백질 (MBP 퓨전 단백질+HeLa 셀 단백질)과 FLAG beads와 한 번 더 인큐베이션합니다 (그림 2). FLAG beads에 결합 단백질 (MBP 퓨전 단백질+HeLa 셀 단백질)을 추출합니다 (그림 2). 추출한 샘플을 젤에 로딩한 다음 단백질을 확인합니다. 젤에서 단백질 확인 후, Mass Spectrometry를 이용해 단백질을 분석합니다. 분석한 샘플을 바탕으로 추가 실험을 통해 타깃 단백질에 결합해서 타깃 단백질의 기능을 조절하는지 확인합니다.

그림 1. MBP 퓨전 단백질 (출처 2).

실험 절차

작은 규모로 먼저 실험 조건을 잡고 그 후 큰 규모로 실험합니다.

· 타깃 단백질의 발현 지역을 PCR로 증폭합니다.

· 젤 러닝을 통해 타깃 지역이 제대로 증폭되었는지 확인합니다.

· 제한 효소를 사용하여 타깃 지역과 pMAL 벡터를 처리합니다.

· 라이게이션 (ligation)합니다.

· 트랜스포메인션 (transformation)합니다.

· 항생제 (예, Ampicillin)가 들어있는 LB에 키웁니다.

· 최종 농도가 0.3 mM이 되도록 IPTG를 넣습니다.

· 30°C에서 2시간 키웁니다 (노트 4).

· 스핀을 해서 펠릿 (pellet)으로 만듭니다. (필요할 때까지 -81°C에 보관을 할 수 있습니다.)

· Column 버퍼를 펠릿에 넣습니다.

· 필요에 따라서 소니케이션 (sonication)을 합니다. (노트 5).

· MBP 퓨전 단백질을 추출합니다.

· 추출한 MBP 퓨전 단백질에 Amylose resin을 넣고, 오버나잇 (overnight) 인큐베이션합니다.

· 컬럼 버퍼로 워싱합니다.

· HeLa 셀을 키워서 HeLa 셀에서 단백질을 추출합니다.

· 추출한 HeLa 셀 단백질에 Protein A beads를 넣어서 4°C에서 한 시간 인큐베이션합니다 (노트 6).

· HeLa 셀에서 추출한 단백질과, 위에서 추출한 퓨전 단백질을 함께 오버나잇 인큐베이션합니다.

· 워싱한 뒤, 100 mM maltose로 실온에서 10분 인큐베이션합니다.

· 위에서 추출한 단백질에 FLAG M2 beads를 넣고, 오버나잇 인큐베이션합니다.

· FLAG M2 beads를 워싱하고 나서, IgG Elution 버퍼를 실온에서 10분 인큐베이션합니다.

· 추출한 용액의 1/10을 젤에 로딩하고, 실버 스테인 (Silver Staining)으로 염색합니다.

· 밴드를 확인 후 나머지 추출물을 젤에 로딩하고, Coomassie Staining으로 염색합니다.

· 웰을 2개로 나누어서 Mass Spectrometry을 위해 샘플을 보냅니다.

· 결과를 받으면 타깃 지역과 결합하는 단백질 후보를 찾습니다.

· 찾은 후보들을 추가 실험을 통해서 타깃 단백질의 기능에 변화가 있는지 확인합니다 (노트 7).

그림 2. MBP 퓨전 단백질 시스템 실험 절차 (출처: 본인)

노트

1. 타깃으로 하는 지역을 벡터에 넣을 때 open reading frame에 맞게 잘 넣어야 합니다. 이번 실험에서는 타깃 단백질의 특정 지역을 넣을 때 FLAG 태그를 특정 지역 아래에 넣어서, 나중에 MBP 퓨전 단백질과 결합하는 단백질은 FLAG beads를 이용하여 따로 추출할 수 있습니다 (그림 2).
2. MBP가 Amylose resin에 단단히 결합함을 이용해서 MBP 퓨전 단백질만 추출할 수 있습니다.
3. MBP만 발현한 단백질도 컨트롤로 인큐베이션합니다. MBP만 발현한 단백질과 MBP 퓨전 단백질의 농도를 측정해서 같은 양으로 HeLa 셀에서 뽑은 단백질과 각각 인큐베이션합니다.
4. 실험을 통해 IPTG 농도와 온도를 결정합니다.
5. 실험을 통해 소니케이션을 해야 할지 결정합니다.
6. 백그라운드를 줄여줍니다.
7. 추가 실험의 예: Immunoprecipitation, Knockdown

출처

1. NEBExpress MBP Fusion and Purification System Quick Start Protocol (NEB #E8201).
2. https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale8201.pdf?rev=66fe20cb2d6246fdab2e7e37af056f08&hash=B884406B57A06CCAB80A90071292F3F1

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