실전 실험 프로토콜 101 연재 목록 | 연재 > Bio뉴스 > 동향

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마감 실전 실험 프로토콜 101 <23화>

논문에 나온 실험을 따라서 하고 싶어도 논문에 실험 절차가 너무 간략하게 소개되어 있거나, 자세한 설명이 없어서 실험을 따라 하기가 어려운 경우가 종종 있습니다. 이럴 경우 '같은 실험실 혹은 주위 실험실에서 실제로 유사한 실험을 한 사람의 실험 노트가 있다면 얼마나 좋을까?' 라고 자주 생각했습니다. 이번 연재를 통해 제가 실험실에서 배운 내용을 같거나 비슷한 분야에서 연구하는 분들과 나누고자 합니다. 물론 제가 소개하는 내용이 최고라고 생각하지 않고, 소개하는 내용보다 더 좋은 실험 방법이 있다고 생각합니다. 이러한 자신만이 알고 있는 실험 방법을 공유하여 주시면, 같은 길을 걷고 있는 분들에게 도움이 되리라 생각합니다.

세오 (필명)

[실전 실험 프로토콜 101] #23. 연재를 마치며

실험 계획을 세우고, 실험 방법을 찾아 준비한 대로 실험을 하면 예상대로 결과가 딱 나올 것 같습니다. 실험이 예상대로 나오면 좋지만, 알 수 없는 이유로 예상치 못한 결과가 나올 수도 있습니다. 어느 쪽이든 실험 결과에 따라 기분이 좋아지거나 나빠지는 일이 자주 있습니다. 하지만, 실험 결과에 너무 감정적으로 반응하지 않으려고 노력하고 있습니다. 연구자로서 수많은 실험을 앞두고 있으므로, 실험마다 기뻐하거나 슬퍼하면 정신적, 감정적으로 힘들어집니다.
- 2024.03.08
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[실전 실험 프로토콜 101] #22. 바이러스 적정(Lenti-X qRT-PCR titration)

신뢰가 가는 연구를 위해서는 재현성이 중요합니다. 특히, 바이러스를 이용한 실험에서 Lentivirus Packaging 과정의 성공 여부와, 복사 수(copy number) 조절을 통한 유전자 발현량을 조절하기 위해서 바이러스 적정(Titrating)이 꼭 필요합니다. 바이러스 적정을 위해서 방법에 따라 다르지만 적정을 하는데 대략 2~10일 정도 걸립니다. 예를 들어, 형광 마커 유전자, 항생제 저항 유전자 혹은 세포의 염색을 검출하는 방법 등이 있습니다. 따라서 빠르게 적정하는 방법의 필요성이 높아지고 있습니다. 이번 연재에서는 정확하고, 빠르고, 간단한 lentiviral stock을 이용하는 Lenti-X-qRT-PCR Titration 방법에 대해 소개하겠습니다. 적정 키트를 이용해서 신속히 RNA 정제를 한 다음, qRT-PCR과 SYBR 기술을 이용하여 바이러스 RNA 유전체 함량을 측정합니다 [노트 1]. 이 키트를 사용하면 바이러스 정제와 타깃 세포 감염 사이의 시간을 줄여, 같은 날 두 가지 작업을 모두 수행할 수 있습니다. 또한, 바이러스 감염성을 감소시키는 시간의 지연과 동결 주기(freeze-thaw cycles)를 피할 수 있습니다. 보다 일관된 결과를 위해 MOI (Multiplicity of infection)로 타깃 세포를 감염시킬 수 있습니다. 결과적으로 재현성 높은 실험 결과를 얻을 수 있습니다.
- 2024.01.08
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[실전 실험 프로토콜 101] #21. 해당과정 스트레스 테스트(Seahorse)

세포는 두 가지 경로(해당과정(glycolysis)과 산화적 인산화)로 에너지를 생산합니다. 세포에서 에너지를 생산하는 두 경로는 서로 전환을 통해 환경의 변화에 적응합니다. 세포 내의 포도당(glucose)은 피루브산(pyruvate)으로 전환된 후 세포질에서 젖산 혹은 미토콘드리아에서 이산화탄소와 물로 전환됩니다 (그림 1). 포도당은 피루브산으로 전환되고, 그 후 젖산이 되면 양성자가 세포 외 배지로 생성되고 압출됩니다. 이때 양성자의 압출은 세포를 둘러싸고 있는 배지의 산성화를 초래합니다.
- 2023.10.31
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[실전 실험 프로토콜 101] #20. MBP 퓨전 단백질 시스템을 이용한 결합 단백질 찾기

타깃 단백질의 기능 중 타깃 단백질의 특정 지역에 어떤 단백질이 결합하여, 타깃 단백질의 특정 기능을 조절하는 타깃 결합 단백질을 찾는 방법에 대해 알아보겠습니다. 타깃 단백질의 특정 지역을 pMAL 벡터의 maltose-binding protein (MBP) 다운 스트림에 넣어서 MBP 퓨전 발현 벡터를 만듭니다 (노트 1, 출처 1). 이 발현 벡터를 박테리아에 넣어서 MBP 퓨전 단백질을 발현시킵니다. 퓨전 단백질의 발현을 확인한 다음, 이 과발현 단백질을 Amylose resin과 인큐베이션 (incubation)해서 발현 단백질만 따로 추출합니다 (노트 2). MBP 퓨전 단백질의 컨트롤로 MBP만 들어있는 단백질을 추출합니다.
- 2023.09.22
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[실전 실험 프로토콜 101] #19. Gibson Assembly cloning (깁슨 어셈블리 클로닝)

지난 연재에서 “유전자 무작위 돌연변이 (Site saturation mutant library)”를 만드는 방법을 소개하였습니다 (출처 1). 엔자임을 처리한 플라스미드와 인서트를 사용해서 라이게이션을 할 경우, 플라스미드 사이즈가 큰 경우에는 transformation이 잘 안 되는 경우도 있습니다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 이번 연재에서는 엔자임을 처리한 것보다 더 좋은 라이게이션 성공률로 원하는 플라스미드를 만드는 것을 소개하겠습니다.
- 2023.08.18
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[실전 실험 프로토콜 101] #18. 유전자 무작위 돌연변이(Site saturation mutant library)

딥 시퀀싱(deep sequencing)의 발전에 따라, 생물 의학 및 생명 공학 연구의 목적으로 특정 유전자의 원하는 위치의 nucleotide 혹은 코돈(codon)을 개별적으로 랜덤 하게 바꾸는 방법(site saturation mutant (SSM) library)이 중요해지고 있습니다. 예를 들어, 단백질의 SSM library와 딥 시퀀싱을 함께 사용하여 단백질 구조, 단백질 안전성 및 단백질 기능에 대한 코돈 특이적 기여를 구별하는 데 사용될 수 있습니다. 이번 연재에서는 inverse PCR을 이용하여 SSM library를 효율적이고, 빠르고, 경제적으로 만드는 방법을 소개합니다.
- 2023.06.28
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[실전 실험 프로토콜 101] #17. Colony formation assay (콜로니 생성 분석)

Colony formation assay (콜로니 생성 분석)은 단일 세포가 생존하고 번식하여 colonies (군체)를 생성하는 능력을 측정합니다. 이 분석은 암세포 생존과 성장에 대한 방사선의 영향을 연구하는 데 사용되었고, 오늘까지 방사선 생물학 (radiobiology)에서 필수적인 역할을 했습니다. 처음에는 방사선 생물학 분야에서 사용되었지만, 암 연구에서 세포 성장과 잠재적인 임상 응용을 가진 다양한 물질의 세포독성 (cytotoxic) 혹은 유전독성 (genotoxic) 효과를 평가하기 위한 표준 방법이 되었습니다.
- 2023.03.20
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[실전 실험 프로토콜 101] #16. 올리고 오버랩 클로닝 (Oligo overlap cloning)

간혹 실험에 사용할 플라스미드 (plasmid)의 Multiple Cloning Site (MCS)에 실험자가 원하는 제한효소가 없는 경우도 있습니다. 이번 연재에서는 플라스미드에 MCS를 바꾸고 싶거나 짧은 태그 (FLAG 혹은 HA)를 넣을 때 사용할 수 있는 올리고 오버랩 클로닝 (Oligo overlap cloning)에 대해 소개하겠습니다.
- 2023.01.19
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[실전 실험 프로토콜 101] #15. G2 checkpoint assay

G2 체크포인트 (checkpoint)는 DNA가 손상됐을 때 세포가 mitosis (유사분열)로 들어가지 못하게 하고, 유전체 보존 (genome integrity)를 보하는 데 도움을 줍니다. 종양 세포는 유전체 불안정성을 유도하...
- 2022.12.08
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[실전 실험 프로토콜 101] #14. 쥐에서 일차 간세포(primary hepatocytes) 추출 방법

일차 간세포 (primary hepatocytes)는 기능적 특성에서 in vitro 간세포보다 in vivo 간세포와 더 유사합니다. 예를 들어, 일차 간세포는 간 생체 검사와 80% 가까이 유사성을 가지지만, HepG2 세포 (간암 세포로 간 기능...
- 2022.10.26
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