목 차 

1. Introduction
2. Sessions
  2.1. Day 1 – Updates in Painful Diabetic Neuropathy Physiopathology: New Frontiers for New Treatment Targets
  2.2. Day 2
    2.2.1. Single-cell RNA-sequencing deconvolutes cellular and molecular responses to diet and exercise interventions in prediabetic neuropathy
    2.2.2. Neuropathic Pain Mechanisms in the Human DRG: Lessons from RNA sequencing
    2.2.3. Proteins: Discovery and validation of Novel Serum Biomarkers for the Diagnosis and Monitoring of Inflammatory Neuropathies
  2.3. Day 3
    2.3.1. INC Project Updates
    2.3.2. Identifying, characterizing and evaluating antibodies in Guillain-Barre syndrome
    2.3.3. The Prevalence and Clinical Features of Anti-Annexin A2 Antibodies in Neuro-pathic Pain
  2.4. Day 4
    2.4.1. The Role of Keratinocyte-Derived Exosomes in DRG Excitability and Nerve Out-growth in Painful Diabetic Neuropathy
  2.5. Poster Session
    2.5.1. Autoimmune Nodopathies – Clinical and Serological Characteristics of Patients from a UK Diagnostic Cohort
    2.5.2. Serum proteome in Guillain-Barre syndrome using aptamer-based proteomics platform
    2.5.3. Anti-HNK-1 IgM and sNfL levels are potential biomarkers for monitoring disease activity in anti-MAG neuropathy
    2.5.4. Clinical Performance and Post-launch Assessment of a Neurofascin-155 IgG4 Flow Cytometry-based CBA
    2.5.5. Assessment of Small Fiber Involvement in Autoimmune Nodopathy by Quantitative Sensory Testing
    2.5.6. Different epitopes in anti-CNTN1-associated autoimmune nodopathy and their association with clinical phenotypes
    2.5.7. Phase 2 Trial of Riliprubart in CIDP: Effect on Complement Biomarkers and Neurofilament Light Chain
    2.5.8. Accelerated Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Schwann Cell Precursors For Modelling Peripheral Neurobiology
    2.5.9. Co-culture of Immortalized Sensory Neurons and Schwann Cells for the Study of Peripheral Neuropathies
  2.5.10. Altered Landscape of Neuronal Gene Expression in Skin Biopsies from Patients with Paclitaxel-Induced Peripheral Neuropathy
3. Conclusion

그림 1. 연구자 간 네트워킹이 주로 이루어지는 부스 전경 

1. Introduction

Peripheral Nerve Society (PNS) meeting은 Journal of Peripheral Nerve System (JPNS) 저널에서 주최하는 학회로, 매년 약 50~60개국에서 1000명 이상의 말초신경을 연구하는 임상 및 기초 연구자들이 모이는 학회이다. 이 학회는 말초신경계 연구의 분야별로 Special Interest Group (SIG) 컨소시엄 여러 개가 합쳐져 운영되는 형태이며, 염증성 신경병(INC), 유전성 신경병(CMT), 당뇨병성 말초신경병(IDNC), 신경병성 통증(NPC), 독성 신경병(TNC) 등으로 구분된다. 따라서 학회는 전체 인원이 PNS 세션 형태로 동일한 강의를 듣거나, 혹은 동시간대에 각 SIG 미팅으로 나누어 진행된다. 올해는 6월 22일부터 25일까지 4일간 캐나다 몬트리올 Palais des Congres de Montreal에서 주최되었다. 이번 참관기에서는 특히 흥미로웠던 일부 주요 발표 및 포스터 내용을 위주로 정리하였다.

2. Sessions

2.1. Day 1 – Updates in Painful Diabetic Neuropathy Physiopathology: New Frontiers for New Treatment Targets
Presenter: Daniela Maria Menichella, MD, PhD (Northwestern University) 

Menichella 랩은 PDN의 새로운 기전을 밝히고 치료제를 발굴하기 위해 optogenetics, chemogenetics, single cell RNA-sequencing, in vivo calcium imaging 등의 최신 연구기법을 활용하며, 특히 cutaneous afferent와 non-neuronal cell 간의 interaction에 초점을 맞추고 있다. Control 마우스 대비 High fat diet를 먹인 마우스(PDN 모델)에서 obesity, glucose intolerance, mechanical allodynia와 small fiber degeneration이 성공적으로 유도되는데, 이때 epidermal Langerhans 세포의 증가함을 확인했다. hLangerin-DTR TG 마우스를 통해 DTX 주입 시 mechanical allodynia가 현저히 완화됨을 확인했으며, single cell RNA-sequencing을 통해 HFD mouse에서 LC의 현저한 pathway 및 DEG 변화를 확인할 수 있었다. LC와 cutaneous sensory afferent가 발현하는 Mrgprd 간 상호작용이 PDN에서의 axonal degeneration에 기여할 것을 cell-cell communication 분석과 histology를 통해 확인하였다. 또한, 현재 PDN 환자에서도 유사한 병리학적 현상이 발견되는지 확인 중에 있다.

2.2. Day 2 

2.2.1. Single-cell RNA-sequencing deconvolutes cellular and molecular responses to diet and exercise interventions in prediabetic neuropathy
Presenter: Junguk Hur, PhD (University of North Dakota)

이 발표는 prediabetic neuropathy에서 식이요법 및 운동요법이 각각 axon-Schwann cell의 metabolic interaction을 향상시킴으로써 치료적 효과를 가질 것이란 가정으로 시작되었다. Standard diet (SD)와 비교하여 HFD mouse, HFD에 식이요법(DR), 운동요법(EX), 둘 모두를 진행한 그룹(DREX)의 phenotype을 체크한 후, 말초신경을 채취하여 single-cell RNA-sequencing을 시행하였다. DR, EX는 각각 체중, 인슐린 내성, 인슐린 및 콜레스테롤 농도, 운동신경전도속도, mechanical allodynia에 긍정적 효과를 보였다.

Single cell RNA-sequencing을 통해 Schwann cell, smooth muscle cell, endothelial cell, fibroblast 등 다양한 세포를 확인할 수 있었고, 그중 특히 Schwann cell의 아형 변화 및 관련 cell-cell communication이 변화하고, DREX에 의해 HFD의 변화가 reversal 되는 것을 확인했다.

2.2.2. Neuropathic Pain Mechanisms in the Human DRG: Lessons from RNA sequencing
Presenter: Theodore Price, PhD (The University of Texas at Dallas)

이 연구는 deceased donor의 감각신경절(DRG)을 공급받아 single cell RNA-sequencing, spatial transcriptomics 등의 기법을 이용하여 질환 기전을 연구한 결과들을 소개했다. 첫 번째는 성별에 따른 통증의 기전 차이에 대한 연구로, 통증이 있었던 사망자와 그렇지 않은 사망자 간의 transcriptomic profile을 비교했을 때, 남성의 경우는 macrophage 및 관련 유전자가 뚜렷한 변화를 보인 반면, 여성은 type 1 interferon이 유도됨을 확인하였다. 이에 착안하여 recovered 된 human DRG에서 patch clamp를 통해 excitability를 비교하였을 때, type 1 interferon에 의한 AP frequency 증가, RMP 감소 등을 확인할 수 있었다.

두 번째 소개된 연구는 PDN을 앓는 사망자의 DRG에서 Nageotte Nodule이라는 병리학적 형상이 높은 빈도로 관찰되며, IHC를 통해 이들이 nociceptor의 axonal sprouting임을 확인했다. 이들의 유전자 발현 특성을 확인하기 위해 spatial transcriptomics를 시행하였으며, integrin, EGFR 및 complement signaling이 활성화되어 있었고, 주로 macrophage에서 분비되는 SPP1이 top DEG로 확인되었다. 이 결과를 validation 하기 위해 시행된 single cell RNA sequencing에서도 macrophage 세포 타입의 주된 변화를 확인하여(SPP1+ 아형 증가 등) PDN의 질병 프로세스에서 면역 활성화가 중요한 기전일 수 있음을 제시했다.

2.2.3. Proteins: Discovery and validation of Novel Serum Biomarkers for the Diagnosis and Monitoring of Inflammatory Neuropathies
Presenter: Michael Lunn (University College of London)

본 강의는 염증성 신경병의 바이오마커 발굴에 있어서 최근 프로테오믹스 플랫폼의 역할에 대한 overview였다. 과거에는 질병 기전 상 중요할 것으로 기대되는 단백질 마커 후보 1종을 검증하기 위해 ELISA, western blot을 시행하는 flow였다면, 점차 기술이 발달하면서 아주 미량의 단백질을 검출할 수 있는 Simoa나 Nulisa 혹은, 수백 종 이상의 단백질을 unbiased 하게 스크리닝 할 수 있는 Tandem mass spectrometry, Olink, Somalogic 등의 도구가 소개되었다.

최근 Olink 플랫폼을 이용하여 약 100명의 CIDP 환자에서 1472개의 단백질을 profiling 한 연구에서는 SUGT1, DCTN1, IRAK4와 같은 마커들의 질병활성도와 관련된 것으로 발견되었다. 이렇듯 unbiased proteomics 접근은 지금까지 발견되지 않은 novel 한 바이오마커 발굴에 효과적일 수 있으나, 기전적 의미 및 해석, 검증에 주의를 기울여야 함을 강조하였다.

2.3. Day 3

2.3.1. INC Project Updates
Presenter: Bart C. Jacobs, MD, PhD (Erasmus MC) / Filip Eftimov, MD (UMC) / Pietro Emiliano Doneddu (IRCCS Humanitas Research Hospital) 

본 세션은 염증성 신경병을 연구하기 위해 전향적인 국제 코호트를 구축하는 상황을 업데이트하는 내용이었다. GBS, CIDP, anti-MAG neuropathy 등의 염증성 신경병은 모두 희귀질환이기 때문에 효과적인 연구를 위해서는 여러 기관, 가능하다면 여러 국가에서 환자의 데이터를 모아 분석할 필요가 있다. 상기 언급한 세 질환에 대한 각각의 대표적인 국제 코호트 연구가 소개되었다(IGOS, INCbase, IMAGine). 이러한 국제 코호트는 참여 및 유지에 연구자의 지속적인 시간 투자와 노력이 필요하다. 진료 업무가 과중된 우리나라의 의료 상황 및 최근 의료 이슈가 심화되면서 이 분야의 코호트에도 우리나라는 참여 중이지 않았으며, 관련 연구가 크게 위축되어 있음이 느껴져 신경과 전문의로서 아쉬움이 남기도 하였다.

2.3.2. Identifying, characterizing and evaluating antibodies in Guillain-Barre syndrome
Presenter: Mariya Misheva, PhD (Oxford University)

GBS는 자가면역 기전에 의해 근위약 및 감각소실이 급성으로 진행되는 신경병이다. 하지만 GBS 환자 중 신경에 대한 자가항체가 발견되는 경우는 일부로, 나머지 환자들에서 자가항체의 타깃을 비롯한 기전은 불투명한 상황이다. 이 연구는 GBS에서 새로운 자가항체를 발견하기 위해 human iPSC에서 유래된 감각신경과 rat의 슈반세포를 co-culture 하여 myelin을 포함한 in situ nerve 모델을 만들고, 여기에 혈청이 반응을 보이는 GBS 환자를 스크리닝 했다. 300명 이상의 환자 샘플 중 4명이 강한 양성 반응을 보였다. 이들과 neuron-Schwann cell coculture를 immuno-precipitation 후 mass spectrometry를 진행하였으며, SCN7A, THBS1, TGFBR3을 각각 타깃으로 발굴 후 이들이 정말 자가항체의 타깃이 되는지 validation 작업을 진행 중이다(cell-based assay).

2.3.3. The Prevalence and Clinical Features of Anti-Annexin A2 Antibodies in Neuropathic Pain
Presenter: Takayuki Fujii (Kyushu University)

ANXA2 IgG는 antiphospholipid syndrome 혹은 systemic lupus erythematosus 환자들에게서 간혹 발견되는 항체이다. ANXA2를 유전적으로 deletion 시킬 경우 small DRG에서 TRPA1 발현 증가 및 활성화를 통해 excitability가 증가함이 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 ANXA2 IgG가 신경병성 통증 환자들에서 발견되는 유병률과 생물학적 연관성에 대해 연구하였다. 37명의 신경병성 통증 환자와 82명의 대조군에서 ANXA2 IgG를 검출하는 ELISA를 시행했으며, 양성 샘플의 경우 주된 IgG subclass를 분석하였다. 또한, ANXA2 IgG가 DRG에 반응함을 증명하기 위해 mouse DRG neuron에 대한 ICC 및 postmortem human lumbar DRG에서 IHC를 진행하였다. 결과, 4명의 신경병성 통증 환자에서 ANXA2 IgG가 검출되었고, 이들은 IgG1 아형으로 확인되었다. 양성 환자들은 CIDP 등 기저 자가면역 질환을 가지고 있는 경우가 많았고, 면역 치료에 따라 신경병성 통증의 임상적 경과와 자가항체 titer가 연관 지어 변동함을 확인했다.

2.4. Day 4 

2.4.1. The Role of Keratinocyte-Derived Exosomes in DRG Excitability and Nerve Outgrowth in Painful Diabetic Neuropathy
Presenter: Daniel Menichella Lab

본 NPC Platform 발표는 앞서 소개한 Menichella Lab에서 시행 중인 연구로, PDN에서 exosome을 통한 keratinocyte-cutaneous nociceptor의 cross-talk을 다루었다. 먼저, primary keratinocyte culture의 conditioned medium에서 extracellular vesicle (EV)을 isolation 하는 프로토콜을 개발하였다. 그 뒤 K14cre::CD63-GFP 리포터 마우스의 EV가 잘 워킹함을 validation 하였다. 이후 regular diet (RD)와 HFD mouse에서 분리한 keratinocyte-derived exosome에서 comprehensive proteomics와 small library RNA sequencing을 시행한 결과, 각각 neurotransmitter secretion과 axon guidance pathway가 enrich 되었음을 확인하였다. 이를 통해, PDN 상황에서 keratinocyte가 분비하는 EV가 통증 및 액손 퇴행을 유발할 수 있겠다는 가설을 제시했다. 현재 이러한 가설을 in vivo에서 검증하고, 가능하면 환자의 샘플에서 엑소좀을 분리하여 연구를 이어갈 계획이라 하였다.

2.5. Poster Session

2.5.1. Autoimmune Nodopathies – Clinical and Serological Characteristics of Patients from a UK Diagnostic Cohort
Presenter: Janev Fehmi (Oxford University)

본 포스터는 Autoimmune Nodopathy 연구의 선두주자 중 하나인 Oxford에서 지금까지 중 가장 대규모의 AN 환자 코호트를 분석한 것이다. 2270명의 샘플 스크리닝을 통해 약 5%에 해당하는 120명의 환자를 확인했으며, 그중 임상데이터가 충분한 88명의 임상양상을 기술하였다.

2.5.2. Serum proteome in Guillain-Barre syndrome using aptamer-based proteomics platform
Presenter: Roger Collet (Hospital de la Santa Creu I Sant Pau)

본 포스터는 GBS 환자의 baseline 및 follow-up 혈청 각 20건씩, 그리고 정상 공여자 15건의 혈청으로 7000개의 단백질을 profiling 하는 aptamer-based proteomics를 진행한 연구의 중간상황을 공유한 것이다. 활동기 GBS 혈청과 정상공여자, 활동기 GBS 혈청과 Follow-up 혈청을 비교함으로써 새로운 GBS의 바이오마커를 찾고자 했다. 본 참석자도 SomaScan을 이용한 novel biomarker 스터디를 계획하고 있어 관심이 갔고, 좋은 설명 가능한 결과를 기대하기 위해서는 연구계획 단계에서 디자인의 중요성을 느끼기도 하였다.

2.5.3. Anti-HNK-1 IgM and sNfL levels are potential biomarkers for monitoring disease activity in anti-MAG neuropathy
Presenter: Elba Pascual-Goni (Hospital de la Santa Creu I Sant Pau)

Anti-MAG neuropathy는 마이엘린을 구성하는 MAG이라는 단백질의 HNK-1 saccharide epitope에 발생하는 자가항체로 생기는 질환이다. 현재 MAG 단백질을 정제하여 제조되는 ELISA kit가 표준적인 진단 도구인데, cut-off titer level에 따른 위양성/위음성 이슈 등 진단적인 제한점이 있다. 본 포스터는 HNK-1을 생성하는 B3GAT1과 CHST10이라는 효소를 HEK293 세포에 co-transfection 시킴으로써 HNK-1 항체를 정확하게 진단할 수 있는 새로운 cell-based assay를 제시하였다. 현재까지는 pilot 규모의 연구로 향후 validation이 필요할 것으로 보인다.

2.5.4. Clinical Performance and Post-launch Assessment of a Neurofascin-155 IgG4 Flow Cytometry-based CBA
Presenter: Jack Wu (Mayo Clinic)

Autoimmune Nodopathy의 가장 흔한 원인항체인 anti-neurofascin-155 antibody를 검출하는 데 있어서 flow cytometry 방법의 유용성을 제시하였다. 현존하는 두 개의 live CBA 방법, line blot 방법, fixed CBA, ELISA를 각각 수행하여 flow cytometry 방법과 성능을 비교하였다. 그 결과 flow cytometry가 객관적이면서도 항체 역가 정량이 용이한 방법으로써 그 장점이 드러났다. 본 참석자도 flow cytometry를 주로 사용하고 있어 관심이 가는 포스터였다.

2.5.5. Assessment of Small Fiber Involvement in Autoimmune Nodopathy by Quantitative Sensory Testing
Presenter: Takayuki Fujii (Kyushu University)

통념적으로 autoimmune nodopathy는 myelinated fiber에 대한 항체로 생기는 질환이므로, small fiber는 침범되지 않을 것으로 기대한다. 규슈 대학의 연구팀에서는 AN 코호트의 임상데이터 (특히 QST 데이터)를 바탕으로 small fiber의 involvement가 존재하고, 면역치료에 따라 이러한 소견 또한 호전됨을 통해 AN에 subclinical 하게나마 small fiber involvement를 유발할 수 있음을 제시하였다. 향후 더 대규모의 AN 코호트에서, 감각뿐 아니라 자율신경 침범 여부, 그리고 small fiber involvement가 생길 수 있는 기전 등에 대한 추가 연구가 필요할 것 같다.

2.5.6. Different epitopes in anti-CNTN1-associated autoimmune nodopathy and their association with clinical phenotypes
Presenter: Julia Gruner (University of Wurzburg)

CNTN1이라는 신경 구성 단백질에 대한 자가항체로 생기는 질환의 epitope을 분석한 흥미로운 연구이다. 같은 단백질을 타깃하는 자가항체일지라도 세부적으로 공격하는 부위, 즉 epitope이 다를 수 있으며, 이에 따라 임상적, 병태생리학적 차이가 생기기도 한다. 독일 Wurzburg 연구팀은 두 가지 방법을 통해 anti-CNTN1 항체의 epitope mapping을 시행하였다. 1) Cell-based assay: CNTN1의 deletion construct 혹은 de-glycosylation variant를 mutagenesis 한 후 transfection 하여 ICC, 2) Human CNTN1의 아미노산 서열을 15-mer 단위의 펩타이드로 배열 후 peptide microarray immunoassay 시행하였다. 그 결과 CNTN1 환자들의 항체가 일부 경우는 FnIII domain을 공격하며, 이 경우 당뇨병이 동반된 경우가 흔했고, Ig domain이 타깃되는 환자들은 glomerulonephritis가 동반되는 등의 임상적 특징의 차이를 발견하였다. 이러한 결과를 validation 하기 위해 보다 많은 수의 환자샘플을 통해 추가 연구를 진행할 예정이라고 한다.

2.5.7. Phase 2 Trial of Riliprubart in CIDP: Effect on Complement Biomarkers and Neurofilament Light Chain
Presenter: Luis Querol (Hospital de la Santa Creu I Sant Pau)

Complement C1s를 억제하는 새로운 개념의 치료제로, CIDP에서 최근 2상 임상시험이 이루어졌다. 피하로 투여하는 이 약제는 immunotherapy-naïve, standard care, refractory 환자들에서 모두 양호한 임상호전을 보였으며, complement 및 NfL 바이오마커에서도 consistent 한 결과를 얻었다.

2.5.8. Accelerated Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Schwann Cell Precursors For Modelling Peripheral Neurobiology
Presenter: Grace McCabe (Anatomic Inc)

최근 in vitro peripheral nerve 모델을 구축하여 연구가 활발히 이루어지고 있다. Murine cell들이 아닌 human iPSC를 사용하는 것이 translatability를 위해 강조되고 있으나, human iPSC로부터 motor 혹은 sensory neuron을 분화시키고, 따로 Schwann cell도 분화시킨 뒤 myelinating co-culture를 유도하는 데에는 많은 시간과 노력이 필요하여 효율적인 연구가 제한되는 경우가 많다. 이 포스터는 Anatomic이라는 회사에서 발표하였는데, 9일 내에 human iPSC로부터 SC precursor를 대량으로 유도할 수 있는 프로토콜을 개발했다. 이렇게 생산된 SCP는 donor와 무관하게, 대표적 SC 마커 및 transcriptome 분석 시 유사한 성질을 갖는 훌륭한 donor-to-donor consistency를 보였으며, motor neuron을 효과적으로 감싸 myelination을 유도하였다. 또한, SC co-culture는 multi-electrode array (MEA) 상에서 정상적인 electrical activity를 유도할 수 있었다. 아직 2D 상황에서 sensory neuron과 SC co-culture 시 myelination이 유도되고 있지는 않아 향후 프로토콜 셋업이 추가적으로 필요할 것으로 보인다.

2.5.9. Co-culture of Immortalized Sensory Neurons and Schwann Cells for the Study of Peripheral Neuropathies
Presenter: Kazunori Sango (Tokyo Metropolitan Institute of Medical Sciences)

In vitro peripheral nerve model을 구축하기 위한 다양한 방법들이 시도되고 있는데, 그중 시중에서 비교적 구입이 용이하고 iPSC을 위한 비용/시간이 들지 않는 Immortalized cell line (ND7/23, IFRS1)을 활용하여 myelinating co-culture를 유도할 수 있다는 포스터였다.

2.5.10. Altered Landscape of Neuronal Gene Expression in Skin Biopsies from Patients with Paclitaxel-Induced Peripheral Neuropathy
Presenter: Nathan P. Staff (Mayo Clinic)

CIPN 분야 선구자인 Nathan P. Staff의 포스터로, 3명의 Paclitaxel 연관 CIPN 환자와 3명의 비신경병 대조군에서 skin biopsy 후 IENFD 분석과 bulk RNA sequencing을 시행하였다. 그 결과, 일부 환자들은 정상 IENFD를 유지하고 있었음에도 불구하고, RNA seq 상에서는 BDNF, NGF 증가 혹은 GRIN3A 감소 등 현저한 전사체 변화를 보이고 있음을 언급하였다.

3. Conclusion

작년에 이어 또다시 Peripheral Nerve Society Annual Meeting에 참석하여 신경병성 통증 질환과 자가면역 신경병에서 진행되고 있는 최신 연구현황을 접할 수 있어 흥미로웠다. 단순히 publication 된 논문들을 접하는 것에, 전국 각지의 연구자가 수행하는 다양한 연구진행 경과를 강연 혹은 포스터의 형태로 접할 수 있으며, 본 참석자와 유사한 연구를 하는 사람들과 친분을 쌓고 대면으로 토론해 볼 수 있어 귀중한 시간이었다. 실질적으로 향후 연구에 참고할만한 교훈을 얻을 수 있었고, 특정 해외 연구자와는 대면으로 만나 본 참석자의 연구 프로젝트에 대해 논의하고 조언을 얻을 기회도 있어 기뻤다. Peripheral Nerve Society Annual Meeting은 말초신경질환을 다루는 임상의사(신경과, 재활의학과, 내분비내과, 종양내과 등) 뿐 아니라 기초 분자/세포/유전/신경생물학을 전공하는 기초 연구자에게도 적극 권할 수 있는 학회이다.