목 차 

1. 서론
1.1. 2024 ASGCT 연례행사 개요
1.2. 학회 등록
2. 본론
2.1. Novel AAV8 and AAVrh39 ITRs and ITR-Proximal regions significantly enhance transgene expression through enhancer/ promoter-like activities
2.2. A genome-wide CRISPR/Cas9 screen identifies an essential role of SLC35A1 in rAAV transduction
2.3. Continued directed evolution of VCAP-101 and VCAP-102 identifies second genera-tion capsids with increased brain tropism in non-human primates and mice
2.4. Multi-step engineered AAV enables whole-brain mRNA delivery
2.5. Optimization of RNA End joining (REJ) to safely and efficiently express large proteins
2.6. Development of ITR-modified AAVrh74 vectors with improved transgene expression in primary human skeletal muscle cells in vitro and in murine skeletal muscles in vivo
3. 결론
4. 참고문헌


1. 서론

1.1. 2024 ASGCT 연례행사 개요

ASGCT는 "American Society of Gene & Cell Therapy"의 약자이다. 이는 유전자 및 세포 치료에 대한 미국의 전문 기관이며, 이 분야에서의 연구, 개발, 응용에 대한 정보 교류와 지원을 위해 설립되었다. ASGCT는 유전자 치료, 세포 치료, 유전자 편집 등과 관련된 다양한 주제에 대한 연구자, 의료 전문가 및 산업 관계자들을 연결하고 지원한다.

필자는 2023년도의 26^th ASGCT에도 참석을 했었다. 이제껏 수많은 과학자들의 BBB를 통과하여 뇌로 약물을 잘 전달하는 전달체 플랫폼에 대한 갈망의 결과 AAV가 몇 년 전부터 떠오르는 샛별로 올라왔고 26^th ASGCT에서는 AAV에 대한 토론의 장의 정점이었다. 과장을 보태서 유전자 치료제 분야에선 80%가 AAV가 주제였다. 이번 27^th ASGCT에서도 역시 AAV는 주된 분야였다. 27^th ASGCT는 2024년 5월 6일부터 11일까지 미국 볼티모어의 The Baltimore Convention Center에서 개최되었다. 월요일부터 토요일까지 개최된 중, Full day lecture는 수, 목, 금만 있었다. 지난 26th ASGCT의 LA convention center가 Baltimore convention center보다 작았는데도 학회장의 열기는 엄청났다. 실제로 ASGCT 참가인원의 수가 지난 7600명에 비해 더 많은 8000명 이상의 연구진들이 이번 학회에 참가했다. 작년과 마찬가지로, Academy에서 눈에 띄는 leading을 하는 그룹은 UMass Chan medical school의 Gao/Tai lab, Stanford Univ.의 Mark kay lab의 성과가 두드러지게 보였다. Gao/Tai lab의 경우, AAV의 element에 대한 연구를 주로 진행하였고, Mark kay lab은 본인들의 랩에서 나온 engineered capsid인 LK39보다 뛰어난 capsid를 찾기 위해 Glycine 256을 이용한 engineering을 진행하였다. 회사의 경우, Voyager는 지난번에 발표한 VCAP-101과 102를 능가하는 gen2라는 캡시드를 도출하여 그 위상을 견고히 보여주었다.

1.2. 학회 등록

학회 등록은 ASGCT 홈페이지를 통해서 가능하고 매해 다르지만 올해의 경우는 23년도 12월 말부터 early-bird 신청자를 받았다. 당연히 early-bird를 통하여 학회를 등록하면 매우 저렴하니 학회 참석 희망자는 빠르게 등록하는 것을 추천한다. 또한, 학회와 제휴된 4성급 호텔들이 제휴되어 있고 방의 수량은 제한적이기 때문에 이 또한 빠르게 등록하기를 바란다. ASGCT의 멤버로 등록하게 되면 훨씬 싼 가격에 학회 등록을 할 수 있기 때문에 무조건 membership 등록을 하고 학회 등록을 하기를 바란다. 필자는 연구원 출신으로 associate members에 등록하여 학회를 참가했다. 학회를 등록하고 제휴된 호텔을 예약하면, 학회 참가증과 예약된 호텔의 invoice가 메일을 통해 받을 수 있다. 학회장 첫날에서의 registration 또한 매우 간단하다. 메일을 통해 받은 학회 참가증의 QR code를 registration 테이블의 화면에 보여주면 명찰이 나오게 되고 이를 목걸이로 만들어준다.

올해 ASGCT는 한 달 전쯤, 포스터 abstract를 공개한다고 하였으나, 연기가 되어 학회 약 2주 전에 abstract이 공개되었다. 관심 있는 그룹이나 주제를 미리 훑어보고 학회에 참석하면 아주 큰 도움이 된다. 또한, ASGCT 애플리케이션이 있어 agenda가 상세하게 나와있고 내가 알림 해 둔 session의 경우 알림이 뜨고 온라인으로 생중계 시청도 가능하기 때문에 같은 곳에서 다른 session을 잠깐 듣는 것 또한 가능하다.

27^th ASGCT가 열린 볼티모어 컨벤션 센터의 풍경

2. 본론

AAV는 유전자 치료제분야에서 현재 촉망받는 delivery form이다. 그 이유는, AAV는 특정 조직에 대한 특이성을 가지고 있고, 사람에게 일으키는 면역원성이 다른 바이러스 전달체에 비하여 낮으며, lenti virus는 사람의 염색체에 삽입이 되어 암을 유발시킨다는 임상결과가 나온 이후로 lenti를 이용한 유전자 치료제는 주춤하게 되었고, AAV가 이 분야에서 뛰어오르게 되었다.

하지만, AAV에도 치명적인 단점들이 있는데, 첫 번째, 간으로 전달이 잘된다. 간은 인간 몸에서의 모든 대사작용이 이루어지는 기관이기 때문에, 아무리 면역원성이 낮은 AAV라도 인간의 몸에 유해한 작용을 하게 된다. 둘째, AAV에 탑재할 수 있는 유전자의 크기는 4.7 kb로 제한적이다. GOI (Gene of Interest)의 크기가 2kb 정도만 된다고 하더라도, mRNA에서 단백질로의 발현량을 높이기 위해선, WPRE와 같은 element는 필수적이다. 또한, promoter, enhancer, kozaq 그리고 poly A와 같이 전사 발현에 필수적인 요소들을 넣게 된다면 제아무리 GOI의 크기가 4.7 kb 이하 여도 AAV에 탑재하기에는 용량이 턱없이 부족하게 된다. 이에 따라, 유전자 치료제 분야에서는 첫 번째, AAV의 transduction이 내가 원하는 장기로 전달하며, 간과 같은 peripheral tissue로는 전달하지 않는 것이 최종목표이다. 둘째, GOI의 크기를 늘리기 위해 GOI를 반으로 쪼개어 다른 AAV에 탑재하는 연구도 진행 중이고 실제 이번 학회 세션에서도 큰 관심과 주목을 받았다.

나는 이 두 부분의 breakthrough들을 중점적으로 보며 학회를 관람했다.

2.1. Novel AAV8 and AAVrh39 ITRs and ITR-Proximal regions significantly enhance transgene expression through enhancer/promoter-like activities

AAV가 인간 몸에 나타내는 독성이 아무리 낮다지만, 타 바이러스에 비하여 낮기 때문에, 많은 AAV는 사람 몸에 높은 면역반응을 일으킬 수밖에 없다. 그렇기에 연구자들은 AAV의 capsid를 engineering 하여 낮은 dose로도 높은 transduction 효율을 보여주는 engineered AAV를 개발 중이다. 하지만, Gao/Tai lab에서는 다른 실험실과는 다르게 IPR이라는 element를 눈여겨보았다.

AAV는 t-shaped structure를 가진 ITR 사이에 GOI를 탑재할 수 있다.

이 ITR은 promoter와 같은 역할을 AAV 안에서 하고 있다고 알려져 있다. 하지만 ITR의 근처에 있는 IPR (ITR-proximal region)은 그 역할이 제대로 알려져 있지 않다. 심지어 대부분의 serotype들의 ITR은 sequence 상동성이 90% 이상으로 높은 반면, IPR의 serotype별 sequence 상동성은 55%~89%로 천차만별이다. Gene size는 105~122 bp들로 매우 작은 크기이다. 저자들은 IPR의 효과를 AAV2, 8 그리고 rh39에서 확인했다. 결과는 매우 흥미로웠다. AAV2의 경우는 IPR이 GOI의 expression level을 소폭 감소시켰고, AAV8에서는 대략 5배, AAVrh39에서는 대략 10배 증가시키는 놀라운 결과를 보여주었다. 또한 연구자들은, IPRrh39의 앞부분의 59bp는 expression repressing activity, 뒷부분의 66bp는 promoter enhancing activity를 가질 것이라고 추측했다. 이 연구는 현재 serotype 2, 8, rh39에서만 진행된 연구로 다른 serotype에서 다른 IPR이 expression enhancing 효과를 지닐지 알아보는 연구는 매우 흥미로울 것으로 보인다.

2.2. A genome-wide CRISPR/Cas9 screen identifies an essential role of SLC35A1 in rAAV transduction

AAV는 현재, 수용체를 매개로 하여 transcytosis를 통해 세포 안으로 들어간 후, 핵 안으로 들어가 episome을 형성한 뒤 방출되어, episome에서 계속적으로 단백질을 발현시키는 mechanism 가지고 있다. 따라서, 원하는 조직에 잘 도달한 AAV가 최종적으로 단백질 발현을 원활히 하기 위해선, cell 안으로 들어가야 하고 그렇기에 우리는 AAV를 transcytosis 시키는 receptor를 찾아내야 한다.

2016년 Nature에 publish 된 논문인, Pillay, S., et al. "An essential receptor for adeno-associated virus infection." Nature 530.7588 (2016): 108-112. 을 참고해 보면, KIAA0319L이라는 단백질을 K/O 시켰을 때, AAV infection level이 0%로 감소하는 엄청난 데이터를 보여주었고 그에 따라 KIAA0319L을 AAVR (AAV receptor)라고 명칭 하였다. 하지만 2016년 이후에도 AAV의 cell entry를 매개하는 여러 수용체들이 밝혀졌다. 즉, AAVR만이 AAV cell entry의 유일무이한 수용체가 아니고, 그에 따라 연구자들은 새로운 수용체를 찾기 위한 연구도 계속 진행 중이다.

그리고 이 그룹에서 CRISPR screening을 통해 찾은 수용체가 바로 SLC35A1이다. CRISPR screening은 HEK293F cell에서 rAAV5를 통해 진행되었고, host gene들의 hit들을 찾아 차례로 knock out 시킨 후, 발현량을 체크한 결과 SLC35A1이 AAVR보다 더 낮은 발현 퍼센티지를 보여주었다. 이 실험결과는 AAV2와 5에서 도출되었다. 흥미로운 점은, 연구자들은 단순히 transduction level만 본 것이 아닌 binding과 internalization level도 확인하였는데, SLC35A1이 transduction에는 95%나 영향을 끼치지만, rAAV5의 entry에는 오직 30% 정도만 영향을 끼친다고 한다.

또한, rAAV1~13까지 전체적인 serotype에서 SLC35A1의 K/O 시켜, HEK cell 안에서의 발현량을 확인해 본 결과, 흥미롭게도 9과 11의 경우는 transduction 효율이 2배 이상 증가하는 양상을 보여주었다. 또한, rAAV2,6과 9 serotype에서 binding과 internalization에는 영향을 끼치지 못하였다. 따라서, 이를 세밀하게 보기 위하여, DAPI와 SLC35A1 그리고 rAAV5를 confocal imaging을 통하여 확인해 본 결과, SLC35A1이 KO 된 cell에서는 nuclear import가 일어나지 않음을 확인하였다. 따라서 연구자들은 SLC35A1이 AAV의 intracellular trafficking to nucleus에 영향을 끼치고, 오직 AAV9과 11을 제외한 serotype들에서 일어나는 현상임을 밝혔다.

2.3. Continued directed evolution of VCAP-101 and VCAP-102 identifies second generation capsids with increased brain tropism in non-human primates and mice

Voyager therapeutics는 Directed evolution을 통한 AAV9 capsid engineering을 통하여 BBB를 잘 통과하는 AAV9을 engineering 하는 platform을 가진 선두기업이다. Voyager는 처음에 PD와 같은 neuronal disease 연구로 시작을 했던 회사로, 신경질환에 대한 이해가 높은 회사로 Brain에 target 하는 AAV를 만드는데 강점이 있는 회사이다. 지난 ASGCT에서는 VCAP-101과 VCAP102를 engineering 하여 선보였고, 이 캡시들과 binding을 잘하는 receptor 또한 찾아내어 사람들이 이목을 한껏 이끌었다. 그리고 올해, 그 receptor의 베일이 드디어 벗겨졌고, 그 receptor는 바로 Alkaline Phosphatase (ALPL)이었다.

일단, Voyager는 TRACER^TM라고 하는 독자적인 플랫폼을 가지고 있는데, TRACERTM란 RNA-based로 directed evolution을 실행하여, DNA level로 engineering을 하는 다른 회사들보다 한 층 향상되어 있는 기술이다. 이런 독자적인 기술로, 그들은 Cynomolgus Macaque라는 계통학적으로 인간과 유사한 원숭이에서 round를 돌려 BBB를 잘 통과하는 capsid를 찾았고 그것이 바로 VCAP-101과 102이다. 이 캡시드들의 또 하나의 장점은, 원숭이 모델의 CNS로만 AAV가 잘 trafficking이 되는 것뿐만 아니라, BALBc나 C57Bl/6J와 같은 mouse model의 뇌로도 AAV가 잘 전달되는 cross-species라는 점이다. 또한, AAV의 단점인 liver targeting issue도 해결이 된 캡시드이다. 이것보다 향상된 capsid를 찾기 위해, 이들은 saturation mutagenesis를 주었고, VCAP-101과 102의 일부분에 point mutation이 무작위로 일어났다. 그 결과, VCAP101과 102보다 뛰어난 brain targeting과 liver detargeting을 가진 캡시드들을 도출해 냈다.

또한 놀라운 것이 캡시드들을 도출해 낸 뒤, Validation 과정을 거쳐 정말 AAV가 뇌로 전달이 잘 되었는지 확인해야 하는데, 이제까지의 기술로는 한 마리의 원숭이에 한 종류의 AAV만 주사해서 확인할 수밖에 없었다. 하지만 Voyager에서는 Capsid에 tag을 달아, 한 마리에서 6종류의 캡시드의 validation을 확인해 볼 수 있는 방법을 새로 발표하였다. 또한, gen2는 cell-specific 하게 neuron과 astrocyte로도 잘 발현을 하는 캡시드이다. 이와 같이 Voyager는 매해, 발전된 캡시드들과 실험법을 발표하며 그들의 발전된 연구성과를 보여주고 있다.

2.4. Multi-step engineered AAV enables whole-brain mRNA delivery

개인적인 감상으로, 이번 학회에서 손꼽히게 novel 한 session 중 하나였다. AAV의 경우 single-DNA virus로 cell entry가 일어난 후, intracellular-trafficking을 통해 핵 안으로 들어간 후, ss-DNA는 ds-DNA가 되고, concatemer를 이루어 episome을 형성하게 된다. 이 episome이 GOI의 stable한 expression을 만들어 주는 방법이다. 하지만, 끊임없이 단백질을 발현하기 때문에, 과한 단백질의 발현은 사람 몸에 부작용을 일으킬 수 있다. 그것은 우리가 단순한 mRNA만 발현을 시키고 싶을 때도 마찬가지이다. 이를 위해 HUIDA에서 개발한 것이 바로 RAAV (RNA AAV)이다. 기존의 AAV와는 다르게, mRNA를 AAV안에 넣어주는 방법이다. 이를 위해서 기존에 있던, t-shaped 구조의 ITR을 없애고, RPS (RNA packaging signals)를 만들어 주었다. 기존의 AAV의 mechanism은 rep protein이 ITR의 RBE (rep binding element)에 달라붙어, 양 옆의 ITR을 REP protein이 감싸고, GOI가 viral genome으로 AAV에 패키징 된다. 저자들은 대신 RAAV의 경우는 RPS element가 RBP (RPS binding protein으로 rep protein이 RPS에 잘 붙도록 modification 시켜준 rep protein임.) 붙고 mRNA가 AAV 안에 패키징 되는 방식이다. 기존의 AAV 대비 RAAV의 생산량을 보게 되면 약 20%의 바이러스 생산량의 감소는 있지만, TEM을 통한 AAV의 morphology를 보게 되어도 AAV와 동일하다. 또한, silver staining 결과도 캡시드의 VP1,2,3가 잘 형성되어 있음을 보여준다. HUIDA 측은 기존의 RAAV1이 존재했으나 낮은 RNA 패키징 효율을 보여주고 있었다. 이들은 RAAV의 버전을 3단계까지 올려 RAAV의 mRNA loading을 6000배 이상, ssDNA의 loading은 14000배 이하까지 낮추는 결과를 보여주었다.

이들은 RAAV의 transient 한 단백질 발현을 확인하기 위해 RAAV-Cre를 tdTomato cell line에 infection 시켰다. RAAV1과 RAAV2는 AAV에 비하여 낮은 MOI에서 낮은 tdTomato 발현량을 보여줬다. 하지만 RAAV3에선 AAV와 같은 tdTomato 발현량을 보여주었고, Cre의 발현량도 Western blot을 통해 확인한 결과, transient 하게 바로바로 사라지는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 이들은 confocal imaging을 통하여, RAAV가 핵 안으로 들어가고, 8시간 후에 GOI를 발현시키는 것을 확인하였다. AAV와 비교했을 때, 빠르게 단백질이 발현되는 것을 보여준다. 또한 RAAV의 nuclear entry는 bafilomycin에 의해 저해된다.

이러한 결과는 또한 in vivo에서 동일하게 보였다. 이들은 Ai9 mouse에 AAV와 RAAV3-Cre를 injection 하였다. 그 결과, Cre는 transient 하게 발현되어 금방 소실되는 반면, tdTomato의 발현이 stable 하게 일어나는 것을 확인하였다.

RAAV는 engineered serotype에서도 잘 작동하였다. 연구진들은 BBB를 통과한다고 잘 알려진 PHPe.B capsid를 사용하였고, 이러한 engineered form capsid에서도 RAAV는 transient 한 단백질 발현을 보여주었다. 이러한 데이터들을 보여주면서 HUIDA는 mRNA의 빠른 decay를 통한 transient protein expression을 통해 안전한 gene editing therapy를 제공한다고 말했다.

2.5. Optimization of RNA End joining (REJ) to safely and efficiently express large proteins

유전차 치료제로써 사용하기에 충족해야 하는 몇 가지 기준들이 있다. 쉽게 사용해야 하며, 효과적이고 정확해야 하고, off-target issue가 없고, 모든 gene들과 cell type에서 사용할 수 있어야 하며 큰 크기의 protein도 발현시킬 수 있어야 한다. 렌티 바이러스와 아데노바이러스에 비해 작은 capacity를 가진 AAV의 경우는 큰 단백질을 발현시킬 수 없다. 이러한 문제를 해결하기 위해 이제까지 연구되어 온 것들이 DNA/RNA trans-splicing system과 Protein trans-splicing (inteins) system이다. 하지만 이것들의 효율은 매우 낮기 때문에 실사용하기에는 어려움이 있다. 연구진들은 이것보다 발전된 방법인 RNA End-Joining (REJ) system을 소개했다. 전달하고자 하는 DNA가 4.7kb 이상인 경우 RNA trans-splicing을 통하여 반으로 나눈 후, 쪼개진 유전자에 REJ module들을 달아준다. 이는 세포 안의 핵 안에서 일어나는 과정이며 splicing 되었던 RNA들이 합쳐지고 full-length의 protein으로 translation 되도록 한다. RBJ module들은 RBJ 안 염기들의 dimerization으로 부착되게 된다. Dimerization에 최적화된 염기쌍들은 screening을 통해 찾았다. 또한, donor와 acceptor에 splice enhancer element를 부착했고, 이 부분이 endogenous spliceosome에 의하여 잘리게 된다. REJ module은 200bp의 작은 size라는 장점이 있고, Dual vector를 사용할 시 7.5kb, Triple vector는 최대 11.25kb까지 전달이 가능하다. 또한 어떠한 벡터와 cassette를 사용할 수 있다. REJ를 통해 합쳐진 full length sanger sequencing 결과를 보아도 깔끔하게 합쳐진 것을 볼 수 있다.

이 기술을 DNA-splicing 기술과 비교하였다. GOI는 YFP를 사용했고 대략 15배 이상 높은 YFP 형광 발현을 보여주었다. Protein-splicing (intein)과 비교했을 때도, intein은 un-spliced protein fragment가 보였으나, REJ module은 깔끔하게 splicing 되었다. 하지만 Raw protein 대비 단백질 발현량은 두 module들 모두 40% 정도로 낮고 비슷한 효율을 보여주었다.

저자들은 이와 같이 AAV의 단점인 cargo size limit을 해결하기 위하여 RNA end-joining module을 개발하였고, 다른 splicing 기술에 비해 높은 정확성을 보여주었으나, intein 기술과 비슷한 단백질 발현량은 다소 아쉬웠다.

2.6. Development of ITR-modified AAVrh74 vectors with improved transgene expression in primary human skeletal muscle cells in vitro and in murine skeletal muscles in vivo [1]

AAV-ITR은 한 쪽 말단이 flanked 된 t-shaped의 구조이다. RBE는 rep binding element로 rep protein이 부착하는 부분이고, ITR의 D part는 FKBP2라는 세포 내 단백질이 붙는 부분인데, FKBP2가 AAV의 second-strand 합성을 저해하는 역할을 한다고 알려져 있다. 이에 따라, 연구진들은 D part를 rational design으로 engineering 하여 GOI의 DNA 합성이 더 활발히 일어나 단백질 발현량을 높이는 연구를 진행했다.

Ration design을 하기 위해서 고려해야 할 사항은 rep protein이 stable 하게 ITR에 잘 binding 해야 하고, D element에는 trs 10nt 크기의 region이 존재한다. 이 부분을 deletion 하게 되면 viral genome의 rescue와 replication에 큰 영향을 끼치기 때문에 이 부분은 conserved 시키고 나머지 부분을 engineering 했다. 연구진들의 랩은 ‘The UNAFold Web Server”라는 프로그램을 통해 얻은 wild-type ITR과 유사한 구조를 가진 GRE라는 element를 소유하고 있다. Trs에 GRE를 연장해서 붙이는 방법으로 Delta-AAV-ITR를 만들었다.

Delta-AAV-ITR을 이용한 AAV의 생산량을 확인해 본 결과, 기존 WT AAV-ITR과 비교하여 미미한 감소량으로 성공적인 rescue-replication과 패키징 기능을 보여주는 것을 확인했다.

다음으로는, transduction efficiency를 보기 위해 HeLa cell에 AAV-hrGFP를 발현시켰다. 그 결과, 기존 대비 약 4.5배의 증가 효율을 보여줬다. Skeletal muscle cell에서도 좋은 효과를 보여주었는데, skeletal muscle cell에서의 발현량을 확인하기 위해 AAVrh74 벡터를 사용했다. Transduction 효율은 무려 34배나 증가할 정도로 엄청난 증대 효과를 보여주었다. 또한, in vivo에서도 효과를 보기 위해 C57BL/6 마우스 모델의 다리 근육에 i.m. injection을 진행했다. 그 결과, 기존 WT 대비 24배나 증대된 transduction 효율을 보여주는 것으로, Delta-AAV-ITR의 ds-DNA synthesis의 영향을 잘 보여주었다.

3. 결론

올해의 session들과 포스터들로 봤을 때 그래도 30%는 세포치료제 그리고 70%는 유전자 치료제로 학회가 구성되었다. 필자는 유전자 치료제 연구원이기 때문에 유전자 치료제 파트를 중점적으로 보았고, Gao/Tai lab의 IPR에 관한 연구가 새로웠고, Capsid engineering 분야에서는 여전히 voyager가 선두를 달리고 있었다. Directed evolution을 통한 capsid engineering은 유리 천장을 향해 달려가고 있고, 이 유리 천장을 부수기 위해 element에 관한 연구라던지, 전혀 보지 못했던 mRNA AAV인 RAAV의 새로운 발표는 너무나도 흥미롭고 새로웠다. 다만 아쉬웠던 부분은, 아직 AAV의 immune response에 대한 정확한 해결이 도출되지 않았고, AAV의 human chromosome으로의 ITR-based integration이 해결되지 않은 숙제로 남아있는 점이다. 내년에 열릴 28^th ASGCT에서는 이런 단점들을 해결할 수 있는 단초들이 많이 발표되고 토론할 수 있는 장이 되길 바라 본다.