목 차 

1. 학술대회 소개
2. More than nine years of survival of a GRMD dog after injection of rAAV-microDystrophin gene therapy
3. AAV vaccine in a preclinical spontaneous canine model of oral melanoma
4. Focused ultrasound (FUS) for improved delivery of AAV vectors to the brain for the treatment of Huntington’s disease
5. In vivo AAV capsid selection at spatial and single-cell resolution
6. Antibody-conjugated AAV vectors for efficient and specific skeletal muscle-directed gene delivery across species
7. Development of Stabilized AAV capsids for vector engineering
8. In vivo targeting of HSC by capsid-engineered AAV vectors
9. Structure-activity relationships guided engineering of AAV capsids with optimized skeletal muscle, cardiac muscle, and CNS tropism
10. AAV-mediated CNS-wide gene delivery via a de novo engineered capsid-human receptor interaction
11. Functional gene delivery to and across brain vasculature of systemic AAVs with endothelial-specific tropism in rodents and broad tropism in primates
12. Directed evolution of an AAV9 library identifies a capsid variant with enhanced brain tropism and liver de-targeting in non-human primates and mice following systemic administration
13. Strong compact neuron-specific promoters for AAV gene transfer
14. Mapping administration route-dependent transduction profiles of commonly used AAV vectors in mice by multiplexed barcode sequencing
15. AAV immune-gene therapy delivers vectorized cytokines to effectively treat high-grade glioma
16. 맺음말
17. 참고문헌


1. 학술대회 소개

제26회 American Society of Gene and Cell Therapy (ASGCT)는 매년 개최되는 Annual meeting으로, 미국시간 2023년 5월 16일-5월 20일 총 5일간 진행된 학회이다. Los Angeles, CA에 있는 Los Angeles Convention Center에서 진행되었다. 이름에서 알 수 있듯 Gene therapy, Cell therapy를 focusing 하는 대형학회 정도라 말할 수 있겠다. 매년 참석자가 증가하는 추세이며 2022년 약 6~7,000명이 참가했으나 올해 2023년은 약 1만 명이 참석한 것으로 확인된다. Keynote speaker로 Jennifer Doudna (Ph. D, UC Berkeley), David R. Liu (Ph. D, Broad Institute, Harvard University, HHMI), Crystal Mackall (MD, Stanford University), Stanley Riddell (MD, Fred Hutchinson Cancer Center), David A. Williams(MD, Harvard Medical School) 총 다섯 분의 저명한 학자들이 초청되었다. 학회가 큰 만큼 총 270여 개의 기업이 참여하여 exhibition hall을 빛내주었다. 대표적으로, Anemocyte, Sanofi, Sarepta Tx, Biogen, CIRM, Citeline, KRIYA, REGENXBIO, Spark Tx, VERTEX, BIOMARIN, CAPSIDA, cytiva, FORGE BIOLOGICS, Oxford Biomedia Solutions, PackGene, Shape Tx, Takeda, Genscript, uniQure, Thermo fisher 등 다국적 기업들이 다수 참여했다.

2. More than nine years of survival of a GRMD dog after injection of rAAV-microDystrophin gene therapy

Caroline LE GUINER (Ph. D, TaRGeT Lab-UMR 1089) 연자는 GRMD dog에 대한 유전자치료 결과를 일부 공개하였다. GRMD dog에 대한 연구 디자인은 본 연자의 2017년 paper에 근거하여 디자인하였다(published in Le Guiner et al. Nat Commun, 2017). rAAV2/8-Spc5.12-canineMD1 (cMD1)을 IV injection route로 전달하였는데, 1E14vg/kg 그룹군 2E13vg/kg 그룹 2가지 dose로 크게 분류하였다. 금번 발표 때 중점적으로 얘기한 부분은 1E14vg/kg 그룹 가운데 9년 넘게 추적하며 현재도 살아있는 실험군에 대한 phenotype follow-up에 대해 보고하였다. Weekly clinical exam을 수행하면서 clinical monitoring을 확인하는데, dysphagia, breathing, muscular firmness 등의 다양한 criteria로 clinical scoring을 매겼다. 그 결과, 건강한 강아지 대비 약 80% 정도의 clinical score를 나타내며 현재까지 건강하게 살아있다고 한다. Structural parameter를 통해 Cardiac function을 함께 확인하는데, 흥미롭게도 9년 넘게 cardiac structural parameter 상에서 어떠한 부정적인 modification이 확인되지 않았다.

3. AAV vaccine in a preclinical spontaneous canine model of oral melanoma

Ester Molina (Ph. D, Aslanidi’s lab) 연자는 AAV를 cancer vaccine으로써의 활용 가능성을 보고하였다. AAV vector 구성을 보면, proteasomal degradation을 막기 위한 AAV capsid 하에 truncated tumor antigen을 발현하고, MHC class I molecule-trafficking signal을 fusion 함으로써 CD4, CD8 T cell 등의 activation 또는 DC로부터의 processing이 증가하도록 구성하였다. 백신으로의 가능성을 확인하기 위해 4가지 서로 다른 strain의 spontaneous oral melanoma가 유도되는 canine dog model을 사용하였다. 4마리 중 절반인 2마리의 dog model은 AAV vaccine에 의해 oral melanoma가 발생하지 않고 survival이 크게 증가하였다. 연자는 vaccine administration 이후 여러 다양한 부작용이 4마리 강아지 모두에게서 발견되지 않았으며, 한 강아지에서는 3가지 종류의 tumor antigen 모두에서 효과가 있었으며, 일부 강아지에게서 vaccine 처리 후 6개월이 지난 시점에서 local recurrence나 lung에서의 metastasis가 관찰되기도 하였다. 본 연자의 study는 spontaneous cancer에 대한 dog model에서의 AAV cancer vaccine의 safety와 그 효능에 대해 처음 보고하는 흥미로운 주제였다.

4. Focused ultrasound (FUS) for improved delivery of AAV vectors to the brain for the treatment of Huntington’s disease

Bernie Owusu-Yaw (BRIGHAM and WOMEN’S HOSPITAL) 연자는 AAV를 전달하여 Brain을 통과할 때 focused ultrasound를 이용하여 아주 단시간의 BBB를 열게 되고(FUS+MB mediated BBB opening) 이 틈에 AAV가 Brain으로 전달되는 방법론에 대해 설명하고, 이러한 방법을 Huntington’s disease model에 적용하여 치료적 접근을 시도한 내용을 발표하였다. Focused ultrasound는 curved transducer로써 target tissue 내에 있는 specific location을 정확하게 targeting 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 원리로는, IV로 주입해 준 micro-bubble이 Focused ultrasound와 만나게 되면 reversible 하게 BBB를 열 수 있는데, 순차적으로는 1) mechanical disruption of tight junctions 2) Increased number of intracellular vesicles and enhanced endocytosis/transcytosis 3) suppression of P-glycoprotein 순서를 따른다고 한다. 연자는 이러한 원리에 더해, ss-AAV9-U6-miR10150-CBA-GFP를 Q175 mice에 전달하였고 일시적인 BBB opening을 위해 FUS+MB mediated BBB opening을 유도하였다. MB을 주입한 후 약 120s 정도의 FUS을 적용하였다(10ms bursts, 1Hz, FUS pressure 0.32 MPa, MB dose: 100 uL/kg). 그 후 AAV를 IV injection (5.5E11 vg/mouse), MRI, Gadolinium IV, MRI 후 Sacrifice 수행하고, 형광 단백의 확인 및 IF를 수행하였다. 그 결과 FUS가 유도된 반쪽 hemisphere에서만 형광이 크게 발현하고, miRNA에 의해 Q175 저해 현상이 관찰되었음을 보고하였다. 단순히 AAV만 전달한 것이 아닌 FUS에 의한 BBB opening을 수반하여 AAV의 전달효율을 증대시키고자 하였으며, 이로 인한 dramatic 한 therapeutic effect를 보고자 한 연구 결과로 해석된다. 다만 FUS+MB의 Hardware가 갖춰져 있어야 하며, AAV는 보통 brain endothelial cell에 위치한 AAVR이라는 receptor를 매개하여 brain으로 전달이 잘되는 것으로 알려져 있는데 tight junction을 일시적으로 풀어 AAV 전달효율을 높이는 방법이 AAVR을 통한 receptor mediated 방법과 비교하여 얼마나 더 효율적인지는 알 수 없는 한계가 있다.

5. In vivo AAV capsid selection at spatial and single-cell resolution

Ashley B. Robbins (Beverly L. Davidson’ lab) 연자는 AAV capsid engineering resolution의 극대화에 관한 연구를 발표하였다. 대게 AAV capsid engineering에 관한 연구는, Bulk tissue profiling level에서 연구되었다. 보통 tissue 전체를 isolation 하여 DNA and/or RNA level에서의 capsid engineering 서열을 확인하곤 하는데, 이러한 방법론의 한계는 서로 다른 cell type 또는 cell type specific 한 AAV capsid를 발견할 수 없다는 점이다. 이를 극복하기 위해 전 세계 과학자들은 single-cell profiling을 통한 cell type specific 한 AAV variants를 일부 발견하고 보고해오고 있다. 연자는, 2018년 Science에 보고된 SPLiT-seq을 기술을 적용하여 [1], Single-cell combinatorial barcoding 시스템을 이용하여 highly multiplexed AAV transduction profiling을 확인할 수 있었다. 2018년 Science의 주요 내용은 SPLiT-seq combinatorial barcoding을 이용하여 정확한 cell type characterization이 가능한 것인데, 이러한 barcoding이 붙여질 때 동시에 AAV capsid에도 동일한 barcoding이 되면서 cell type이 특정됨과 동시에 해당 cell type에 enrichment 되는 capsid sequence를 확인할 수 있는 아주 똑똑한 방법을 보고하였다. 이러한 방법(AAV-SPLiT-seq)을 기반으로 10개 정도의 major cell type에 대해 cell-type and region-specific capsid를 발견하고, 이러한 data를 역으로 계산하여 striatum, cortex, thalamus, hippocampus 등 주요 brain 조직에 대해 tropic AAV variants를 보고하였다. 이러한 연구방법론은 곧 publish 예정이라고 연자가 설명을 덧붙여주었다.

6. Antibody-conjugated AAV vectors for efficient and specific skeletal muscle-directed gene delivery across species

Poulami samai (REGENERON) 연자는 AAV capsid 표면에 항체를 붙여 specificity를 부과하는 연구내용을 보고하였다. 일반적인 reference capsid를 3D 구조 형태로 보면 capsid의 variable region(VR) 4번, 8번이 가장 capsid 외부로 노출되어 있는데, 이러한 특징은 많은 연구진이 VR 4, 8번 region에 대한 capsid engineering을 수행하는 대표적인 이유가 된다 [2]. 연자들은, 이렇게 외부로 노출된 VR-4, VR-8 위치에 SpyTag이라 명명하는 13 amino acid를 삽입하였고, 이러한 SpyTag이 붙어있는 AAV가 SpyCatcher가 달린 mAb와 만나게 되면 SpyCatcher-SpyTag protein conjugation system이 완성되는데, 이때 SpyCatcher와 fusion 되어 있는 mAb에 의해 tissue or cell type specificity가 부여되는 것이다. 저자들은 위 PoC (Proof of Concept)을 검증하기 위해 skeletal muscle에서만 특이적으로 발현하는 CACNG1 receptor에 대해 anti-CACNG1 mAb을 제작하였고, SpyCatcher-SpyTag AAV를 제작하여 human sample, mouse level에서 검증하였다. 그 결과, human, mouse 모두에서 대조군 대비 실험군(CACNG1 mAb)에서 skeletal muscle specific AAV 전달이 관찰되는 것을 확인하였다. 연자는 이러한 특성을 therapeutic approach로써 동시에 접근했는데, CK8-cDys으로 구성된 AAV vector를 SpyCatcher-SpyTag AAV (anti-CACNG1)로 제작하여 D2-mdx disease model mouse에 전달하여 그 효과를 관찰하였다. 연자는 이러한 특성을 CNS에 적용하여 BBB crossing 되는 SpyCatcher-SpyTag AAV (anti-TfR)를 제작하고 mouse level에서 검증하였다. 총 7가지의 human TfR Fab 항체를 제작하여 SpyCatcher-SpyTag AAV (anti-TfR)을 제작하였고, 이러한 AAV는 우수한 BBB crossing 능력을 보여주었다.

7. Development of Stabilized AAV capsids for vector engineering

Simon Pacouret (BROAD INSTITUTE) 연자는 AAV capsid마다 서로 다른 Melting Temperature (Tm)를 가지는 특성에 주목하였다. 이때까지 다양한 capsid 서열을 가진 AAV variants가 보고됐는데, 그중 가장 대표적인 variant로써, PHP.eB가 있다 [3]. 이 variant는 Viviana gradinaru lab에서 보고된 variant로써 현재 가장 활발하게 사용되고 있는 AAV variant이다. 연자는 PHP.eB를 비롯한 총 160여 개의 engineered AAV9 variants의 Tm을 측정하였고, 전체의 약 97%가 AAV9-WT 대비 destabilized 되어 있는 것을 확인하였다. 연자는 이러한 사실에 근거하여, AAV9 capsid 내에 다양한 mutation을 유도하여 다양한 variants를 유도해 내고, 이를 thermal stability 관점에서 Capsid Tm을 분석하였다. 그 결과 Tm이 안정적인 7개 variants를 발견하였고 각 mutant의 생산성도 AAV9-WT과 유사한 것으로 확인되었다. 연자는 stable 한 Tm을 가진 variants에 더하여 VR-8 위치에 PHP.eB 서열의 7mer insertion을 추가로 수행하여, CNS로의 Tropism을 가지면서 동시에 Tm-stable 하며 생산성이 우수한 variants를 최종 선정한 내용을 보고하였다.

8. In vivo targeting of HSC by capsid-engineered AAV vectors

Nadja Meumann (Hannover medical school) 연자는 HSC targeting tropism을 가진 AAV variant 개발에 대한 연구내용을 발표하였다. 연자는 HSCGT (Hematopoietic stem cell gene therapy)의 한계를 지적하면서 발표를 시작하는데, HSCGT는 주로 ex vivo level에서 유전자교정 후 다시 환자에게 넣어주는 방법론을 따르는데, 이러한 방법론은 Risk-full 하며 complex technical effort가 요구되며 동시에 high costs 한 단점이 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, in vivo HSCGT를 목적으로 HSC-directed AAV capsids 개발을 목표하였다. 연자는, AAV2 (7-mer) peptide display library를 구성하여 NHP (Non-human primates) level에서 2-round selection을 거쳤다. 이때 사용한 rhesus macaque는 pre-conditioning 하였다(G-CSF and plerixafor for CD34⁺ cell mobilization). AAV library injection 48시간 후 BM과 PB로부터 HSPC를 harvest 하고, 약 30개 정도의 variants를 얻을 수 있었다. 그 후 hCD34+ humanized NSG mice level에서 barcoded AAV를 주입하고 CD34⁺ FACS 분석, CD34⁺ cell과 tissue들의 collection, NGS multiplexed BC biodistribution 분석을 통해 총 2개의 variant로 추려냈다. Top variant를 선정하기 위해, pre-conditioned Rhesus macaque을 대상으로 3E12 particle의 AAV를 주사하여 HSC tropic AAV variant를 최종 선정하였다(Var30).

9. Structure-activity relationships guided engineering of AAV capsids with optimized skeletal muscle, cardiac muscle, and CNS tropism

Kevin Olivienri (Affinia Tx) 연자는 AAV9 based capsid engineering을 통해 muscle, cardiac, CNS tropic AAV variants 발견에 관한 내용을 발표하였다. 기존 paper에 따르면, Myotropic peptide in VR-8 in AAV9의 흥미로운 특징으로 insertion peptide 서열 공통으로 RGD peptide motif를 가진다는 사실이다. 연자는 이러한 사실에 근거하여, RGD motif 고정한 VR-8 library에 더하여 VR-1 region에 대한 peptide library를 추가함으로 liver de-targeting까지 수반되는 capsid variant인 M1, M2를 개발하였다. M1, M2는 liver에 대해서는 AAV9-WT 대비 6배 de-targeting 효율을 가짐과 동시에 ventricle wall, biceps femoris, diaphragm, tibialis anterior, triceps brachii 등에서 expression level을 비교해 본 결과 skeletal myocyte에서 약 500배, cardiomyocyte에서 약 75배 뛰어난 발현량을 나타내었다. 같은 방법으로 heart tropic AAV variant인 H1, H2를 개발하였다. H1, H2는 AAV9-WT 대비 약 100배 뛰어난 발현량을 나타내었다. 또, 동일한 스크리닝 방법을 기반으로 CNS tropic AAV인 N1, N2, N3, N4를 개발하였다. Cerebral cortex, cerebellum, putamen, thalamus, globus pallidus, caudate, substantia nigra 등에서 발현량을 비교해 본 결과 약 10-10000배 높은 발현량을 나타내었다. 연자는 이러한 variant를 기반으로 추가적인 promoter, enhancer, GOI modification을 통한 최적의 vector design을 개발하겠다는 포부를 내비췄다.

10. AAV-mediated CNS-wide gene delivery via a de novo engineered capsid-human receptor interaction

Ken Chan (Deverman’s lab) 연자는 capsid-human receptor interaction을 기초한 방법을 통해 capsid variant 발굴을 수행하였다. 연자는 본질적인 질문을 던지며 발표를 시작하는데, 기존의 다양한 variant 들의 발견이 mouse, NHP based 스크리닝을 수행하여 variant를 찾아냈는데, 이렇게 발굴된 variant들이 human에게 translation 될 것이라는 근거가 빈약하다는 것이다. 동시에 새롭게 발굴된 variant 들의 enhanced properties가 human에서도 동일하게 적용될 수 있을 것이라는 근거 기반의 연구 디자인이 될 필요가 있다는 중요한 점을 지적하였다. 연자는 이러한 문제를 극복하기 위해, Ly6A-Fc, LY6C1-Fc에 selective 하게 binding 하는 capsid 수천 개를 스크리닝 했다. Round 1 direct-binding screen을 통해서 LY6A에 binding 하는 BI-48, BI-49 variant를 찾아냈고, LY6C1에 binding 하는 BI-28, BI-62, BI-65 variant를 찾아냈다. 이러한 variant를 검증하기 위해 in vivo model에서 validation을 수행하였다. Human BBB1이 knock-in 되어있는 mouse model에서 발굴한 capsid variant를 검증한 결과 AAV9-WT 대비 Brain, spinal cord에서 약 40~60배 정도 뛰어난 발현량을 나타내고, 기타 CNS를 제외한 tissue에서는 뚜렷한 증가를 보이지 않았다. 위 연구진의 연구 방법이 타 연구실과 다른 점은, AAV를 이용한 directed evolution을 수행할 때 대게는 in vivo level에서 다수의 round를 수행하여 capsid enrichment score를 기반으로 variant rank를 발견하는 반면 Deverman’s lab에서는 human receptor에 대한 direct-binding 스크리닝을 수행함으로 time-saving 함과 동시에 human에게 도출된 결과가 translation 될 수 있는 근거를 제시할 수 있는 강점을 주장하였다. Leading group으로서 우수한 접근법을 보여준 좋은 사례라 생각한다.

11. Functional gene delivery to and across brain vasculature of systemic AAVs with endothelial-specific tropism in rodents and broad tropism in primates

Xinhong Chen (Viviana gradinaru’s lab) 연자는 아주 흥미로운 접근을 시도하는데, 바로 brain endothelial cell을 단순히 BBB 통과를 위해 거쳐 가는 세포가 아닌, Brain의 bystander effect를 이용하는 하나의 세포로써, therapeutic protein을 생산하거나 secret-out 하는 Bio-factory 관점으로 해석한 것이다. Viviana gradinaru lab은 AAV capsid engineering을 선도하는 그룹 중 하나로써 관련 기업으로 CAPSIDA Inc.가 있다. 연자는 mouse brain endothelial cell에 특이적 tropism을 가진 AAV로써 AAV9-X1을 개발하였다. AAV-X1 variant를 이용하여 HEVIN 유전자를 전달한 결과 Brain endothelial cell에 AAV-X1이 잘 전달되고, endothelial cell에서 생산/분비된 HEVIN 단백질은 secretion 되어 HEVIN 유전자 KO model에서 therapeutic effect를 관찰하였다. 이러한 brain endothelial cell을 bio-factory 관점으로 바라본 연구 결과는 비단 Viviana gradinaru lab 뿐만 아니라 BROAD에서도 비슷한 연구 결과를 포스터를 통해 보고하였는데 secretion protein 중 하나인 human IDS를 전달하여 치료 효과를 확인하였다. 또한, 연자는 BALB/cJ 또는 CBA/J와 같이 Ly6a가 발현하지 않는 mouse strain에 AAV1-X1 variant에 CAG-Ly6a를 전달하여 Ly6a receptor의 과발현을 유도한 후 AAV9-PHP.eB를 전달한 결과, 기존에 전달되지 않던 PHP.eB의 전달 효율이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

12. Directed evolution of an AAV9 library identifies a capsid variant with enhanced brain tropism and liver de-targeting in non-human primates and mice following systemic administration

Tyler Moyer (Voyager Tx) 연자는 voyager 기업의 AAV capsid engineering 현주소를 발표하였다. Voyager는 AAV capsid engineering을 leading 해가는 대표회사 중 하나로써, RNA enrichment score를 기반으로 TRACER 스크리닝 방법을 개발한 기업이다. Voyager는 AAV9의 VR-4번 위치에 대해 peptide insertion library를 통해 NHP (Rhesus macaque) 기반의 in vivo 스크리닝을 수행하였다. 2번의 NHP level에서의 스크리닝을 통해 약 1500여 개의 capsid를 추려내고, 이를 다시 NHP, mouse (C57Bl/6, BALB/c) level에서 3번째 스크리닝을 수행하였다. 그 결과 우수한 variant로써 VCAP-101, VCAP-102를 발굴하고 그중에 VCAP-102를 Powerful 한 variant로 선정한다. 연자는 VCAP-102에 대한 DNA, RNA, Protein level에서의 다양한 분석 방법의 결과를 공유하는데, 전반적으로 CNS에 전달이 잘되어 발현량이 높게 유지되는 반면 Liver, Heart, DRG 등에는 de-targeting 현상이 잘 관찰되는 것을 보여준다. 연자는 VCAP-102가 가장 우수함에도 VCAP-101, VCAP-102 서열을 모두 포함하는 mutagenesis를 유도하여 VCAP-102보다 월등히 우수한 Gen2 variant를 보고하였다. Gen2 variant가 enrichment score가 1등이라면 우수했던 VCAP-102는 약 600대를 나타내며 Gen2 variant가 VCAP-102 대비 CNS tropism이 높고 liver de-targeting은 낮은 결과를 보여주었다. 아마 내년 2024년 ASGCT에서는 Gen2 variant에 대해 DNA, RNA, Protein level에서의 AAV9-WT 대비 fold change를 적나라하게 보여줄 것으로 기대가 된다. 대부분의 과학자들이 Voyager의 발표에 큰 관심과 기대를 나타냈으며 뛰어난 성과에 대한 존중과 인정을 나타낸 기억이 난다.

13. Strong compact neuron-specific promoters for AAV gene transfer

Xiupeng Chen (Guangping Gao’s lab) 연자는 AAV에 적용 가능한 compact 한 promoter engineering을 수행하였다. AAV에 load 할 수 있는 GOI 등 유전서열의 capacity는 ITR to ITR 약 4.7kb 정도로 알려져 있다. 이렇게 제한된 gene capacity 때문에 genome size가 큰 유전자나 promoter는 사용하기 어려운 제약이 있다. 특히, promoter의 크기가 커지면 커질수록 load 할 수 있는 유전자의 크기가 작아진다. 이러한 AAV의 고유한 특성은 곧 강력한 발현량을 유지한 채 genome size가 작은 promoter/enhancer의 개발이 필요성이 되기도 한다. 연자는 AAV-mediated expression을 목적으로 compact promoter들을 조사하였다. 현재까지 알려진 compact promoter로는 MeCP2 (truncated, 229bp), Gusb (378bp), CB (truncated, 260bp), U1a (251bp), EF1a (truncated 212bp), F5_tg83 (184bp), Jet (164bp) 정도를 얘기할 수 있다. 연자는 SMN promoter에 기초하여 compact size의 promoter를 디자인하였고, truncated SMN promoter 하에 GFP를 발현시킴으로써 GFP 발현량에 따라 효과적인 promoter를 선정하였다. Truncated SMN promoter는 61bp, 155bp, 303bp 총 3가지를 테스트하였는데 vitro level에서는 61bp도 뛰어난 발현량을 나타내었지만, in vivo level에서는 발현하지 못했다. 그러나 155bp, 303bp truncated SMN promoter는 vitro, vivo 모두에서 강력한 발현량을 나타내며 whole brain 전반적인 distribution을 보여주었다. 특히 155bp truncated SMN promoter는 현재까지 잘 사용되고 있는 short promoter 크기보다도 작은 size이므로 novelty가 있다고 할 수 있겠다.

14. Mapping administration route-dependent transduction profiles of commonly used AAV vectors in mice by multiplexed barcode sequencing

Sarah Abele (Boehringer Ingelheim) 연자는 injection route dependency에 따른 AAV tropism이 달라지는지 transduction profile을 확인해보고자 했다. 연자는 34개의 잘 알려진 natural and capsid-engineered AAV variant에 대해 intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), intratracheal (i.t.) injection을 수행하고 다양한 방법으로 biodistribution을 확인하였다. 방법론으로는 34개 AAV variants에 대해 3’UTR에 barcode (BC)를 넣고, 각각의 virus를 생산한 다음 동일한 titration을 맞추었다. Injection 후 14일째에 18개의 major tissue를 harvest 하였고, isolated RNA/DNA에 대해 BC region을 NGS를 통해 확인함으로써 biodistribution을 확인하였다. 또한, i.t. injection 방법으로 C57BL/6 mice에 전달한 후 injection 후 14일째에 harvested lung에서 single cell isolation을 수행하여 single-cell RNA seq을 수행하였다. 흥미로운 점은, injection route에 따라 동일한 AAV이더라도 tropism이 상당히 많이 달라질 수 있음을 시사하였다. 실제로, AAV6.2, AAV-DJ variant는 i.v. injection시 liver tropism을 보이나 i.p. injection에는 그렇지 않았다. 반대로 AAV6.2, AAV-DJ variant는 i.p. injection시 diaphragm, pancreas tropism을 보이나 i.v. injection에는 그렇지 않았다. 또한, AAV6.2, AAV6, AAV-DJ 세 종류의 AAV variant는 i.t. injection시 가장 효과적인 murine lung tropism을 확인하였고, AAV2-ESGHGYF는 endothelial cell tropism을 확인할 수 있었다.

15. AAV immune-gene therapy delivers vectorized cytokines to effectively treat high-grade glioma

Nicole K. Paulk (SIREN Biotechnology) 연자는 cytokine을 AAV에 load 하여 glioma에 대한 치료적 접근을 시도한 내용에 대해 발표하였다. 기존의 cytokine을 전달하는 방법의 한계로는 cytokine의 과도하게 짧은 반감기를 극복하기가 어려웠다. 연자는 이러한 한계를 극복하기 위해 cytokine을 vectorize 하는 방법을 선택하였다. Cytokine을 이러한 방식으로 전달하면 long-term, steady, durable expression이 가능해지는 장점이 있다. 연자는 human glioma tumor cells (GBM6-FL)을 mouse에 implant 하고 tumor growth, necrosis, angiogenesis 그리고 invasion 할 때까지 기다린 후 convection enhanced delivery (CED) 방법을 이용하여 intratumoral AAV9-hIFNβ infusion을 시도하였다. 그 결과, xenograft mice with human glioma (GBM6-FL)과 PDX mice with primary human glioma에서 약 30~60% 정도의 survival이 관찰되었다.

16. 맺음말 

제26회 ASGCT에서 다룬 AAV, 유전자 가위, CAR-T, HSCGT 모두 오늘날 다양한 연구, 임상 분야에 적용되고 있는 전달체이자 기술이자 방법론임이 분명하다. 특히, AAV는 FDA에서 최근까지도 승인받고 있는 gene therapy product의 대표주자라 할 수 있겠다. Glybera, Luxturna, Zolgensma, Roctavian, Ipstaza, Hemgenix가 그 예가 되겠고, 최근 2023년 6월에는 DMD 질환에 대한 첫 번째 gene therapy로써 ELEVIDYS가 FDA로부터 승인받았다. 이처럼, AAV의 장점을 기반으로 새로운 질환과 새로운 형태의 AAV gene therapy는 계속 시도되고 승인받을 것이 분명해 보인다. 필자는 이러한 Gene and Cell therapy의 흐름 가운데 AAV를 활용한 다양한 연구와 치료적 접근을 제26회 ASGCT 학회를 통해 간접적으로 경험해 보았다.

제27회 ASGCT는 2024년 5월 7일~11일, Baltimore Convention Center에서 개최된다. AAV를 비롯한 Gene and Cell therapy에 대한 전반적인 동향이 궁금한 독자가 계신다면 참여해 보길 적극 권장하며 본 학회 참관기를 맺음 한다.

17. 참고문헌 

==>첨부파일(PDF) 참조