목 차

1. 서론
2. 바이러스
  2.1. 바이러스 전달체
  2.2. 표적 전략
  2.3. LV를 이용한 in vivo CAR-T 연구 동향
  2.4. EDV-AAV
3. 지질 나노입자
  3.1. LNP의 공학적 설계 원리
  3.2. LNP 조성 공학
  3.3. T 세포 표적화 공학
  3.4. RNA 페이로드 공학
4. In vivo CAR-T 바이러스 전달체의 한계 및 극복 전략
  4.1. In vivo CAR-T 바이러스 전달체의 한계
  4.2. In vivo CAR-T 바이러스 전달체의 극복 전략
5. In vivo CAR-T LNP의 한계 및 극복 전략
  5.1. In vivo CAR-T LNP의 한계
  5.2. In vivo CAR-T LNP의 극복 전략
6. In vivo CAR-T의 치료 전망
7. 참고문헌


1. 서론: CAR-T 치료의 패러다임 전환: in vivo CAR-T 치료의 부상

면역치료 기술의 지속적인 발전과 함께 CAR-T는 혈액암 치료 분야에서 획기적인 임상적 성과를 거두며 대표적인 세포치료제로 자리매김하고 있다. CAR-T 세포 치료는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하도록 유전적으로 조작된 T세포를 이용하여 암세포를 선택적으로 인식하고 제거하는 치료 전략이다 [1, 2]. 현재까지 7개의 CAR-T 치료제가 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았으며, 이는 환자로부터 T세포를 채취한 후 바이러스 벡터를 이용해 CAR 유전자를 도입하고, 세포 배양 및 품질관리 과정을 거쳐 다시 환자에게 투여하는 ex vivo 방식으로 제조된다 [1, 2] (표 1). 현재 승인된 CAR-T 세포 치료제는 주로 CD19 또는 BCMA를 표적으로 하며, 불응성 급성 림프모구백혈병, B세포 림프종 및 다발성 골수종 등에서 우수한 항암 활성을 입증하였다. 최근에는 이러한 접근법이 자가면역질환에서 병원성 B세포를 제거하는 치료 전략으로도 확장되면서, CAR-T 세포 치료의 적용 범위가 다양한 질환으로 확대될 가능성이 주목받고 있다 [1, 2].

그러나 환자 맞춤형 제조를 기반으로 하는 기존 CAR-T 세포 치료는 긴 제조 기간, 높은 비용 및 복잡한 공급망이라는 근본적인 한계를 지닌다. 또한 치료 전 시행되는 림프구 고갈(lymphodepletion) 전처치는 혈구감소증과 감염 위험을 증가시켜 임상 적용에 추가적인 부담으로 작용한다. 이러한 한계를 극복하기 위해 건강한 공여자의 T세포를 이용하는 동종(allogeneic) CAR-T 치료가 대안으로 제시되었으나, off-the-shelf 형태로 공급할 수 있다는 장점에도 불구하고 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease)과 숙주 면역계에 의한 거부 반응 등의 문제가 여전히 남아 있다 [1, 2]. 또한 유전자 편집 기술을 활용하여 이러한 면역학적 문제를 완화하더라도 림프구 고갈을 위한 화학적 전처치를 완전히 배제하기는 어려우며, 이로 인한 장기간의 혈구감소증과 감염 합병증 역시 중요한 임상적 한계로 남아 있다 [1]. 이처럼 기존의 ex vivo CAR-T 세포 치료는 제조 및 면역학적 측면에서 여러 제약을 지니고 있다. 이에 따라 복잡한 세포 제조 과정을 단순화하는 동시에 치료의 접근성과 안전성을 향상시킬 수 있는 새로운 전략으로, in vivo CAR-T 세포 치료가 주목받고 있다 [1-3].

In vivo CAR-T 세포 치료는 CAR 유전자를 체내 T세포에 직접 전달하여 환자의 면역세포를 CAR-T 세포로 재프로그래밍하는 접근법으로, 기존 ex vivo 방식에서 요구되는 세포 채취, 유전자 조작, 배양 및 품질관리 등의 복잡한 제조 과정을 생략할 수 있다는 장점이 있다. 나아가 전달 기술의 발전에 따라 기존 CAR-T 치료에 수반되는 림프구 고갈 전처치의 필요성을 줄이거나 배제할 가능성도 제시되고 있다. 이러한 전략을 성공적으로 구현하기 위해서는 CAR 유전자를 원하는 면역세포에 선택적이고 효율적으로 전달하여 충분한 수준으로 발현시킬 수 있는 in vivo 전달 시스템의 개발이 필수적이다. 특히 바이러스 벡터와 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP)는 높은 전달 효율과 플랫폼 확장성을 바탕으로 in vivo CAR-T 구현을 위한 주요 전달체로 활발히 연구되고 있다 [1, 2] (그림 1).

본 동향리포트에서는 in vivo CAR-T 세포 치료를 구현하기 위한 주요 전달 플랫폼을 소개하고, 바이러스 벡터와 LNP 기반 전달 시스템의 특징 및 최신 연구 동향을 비교 분석한 후 향후 기술적 과제와 발전 방향을 고찰하고자 한다.

표 1. FDA 승인된 CAR-T 세포 치료제

그림 1. Ex vivo CAR-T 및 In vivo CAR-T 세포 치료 전략의 비교

2. 바이러스

2.1. 바이러스 전달체

렌티바이러스(lentivirus, LV)는 외피를 가진 레트로바이러스로, 단일가닥 RNA 유전체를 역전사 한 후 숙주세포의 유전체에 통합하는 특성을 가진다. 복제불능성 통합형 LV는 세포의 분열 여부와 관계없이 유전자를 전달할 수 있으며, 도입된 CAR 유전자를 장기간 안정적으로 발현시킬 수 있어 ex vivo CAR-T 세포 제조에 널리 사용되고 있다. 그러나 체내에 직접 투여할 경우 비표적 세포에 전달된 유전자 역시 장기간 발현될 수 있으므로, in vivo 적용을 위해서는 높은 세포 선택성과 유전체 통합에 따른 안전성을 보다 엄격하게 확보해야 한다 [4, 21]. 이러한 세포 선택성과 전달 특성을 결정하는 핵심 요소 중 하나가 LV 표면의 외피 단백질이다. 서로 다른 바이러스의 외피 단백질을 적용하는 슈도타이핑(pseudotyping)은 LV의 세포 친화성(tropism)을 조절하는 전략으로, 입자의 생산성과 혈중 안정성, 기존 면역에 의한 중화 회피, 표적 세포 선택성 및 비표적 전달을 종합적으로 조절할 수 있다 [1, 2, 21, 25] (그림 2).

일반적인 ex vivo CAR-T 제조에는 vesicular stomatitis virus glycoprotein G (VSV-G)로 슈도타이핑된 LV가 주로 사용된다. VSV-G는 다양한 세포에서 발현되는 LDL receptor (LDL-R) 계열 수용체를 통해 세포 내 유입을 매개하므로 높은 전달 효율과 넓은 세포 친화성을 제공한다. 그러나 이러한 광범위한 tropism은 체내 투여 시 표적 세포 선택성을 제한하는 요인이 된다 [4, 5]. 따라서 in vivo 적용을 위한 VSV-G 기반 LV에서는 LDL-R 계열 수용체와의 자연적인 결합을 감소시키는 de-targeting과 함께, T세포 표면분자를 인식하는 별도의 표적 결합체를 부여하는 re-targeting 전략이 개발되고 있다. 이를 통해 VSV-G의 막 융합 기능은 유지하면서 비표적 세포로의 유입을 감소시키고 T세포 선택성을 높이고자 한다 [10, 20, 21].

VSV-G 이외에도 Cocal virus, measles virus (MV), Nipah virus (NiV), Sindbis virus 등에서 유래한 다양한 외피 단백질이 LV 슈도타이핑에 활용되고 있다. Cocal virus의 glycoprotein은 VSV-G에 비해 사람 혈청에 의한 비활성화에 대한 저항성이 높은 것으로 보고되었다. 한편 MV와 NiV는 세포 수용체를 인식하는 attachment protein과 막 융합을 담당하는 fusion protein이 서로 분리되어 있어, 표적 세포 인식과 막 융합 기능을 독립적으로 조절할 수 있다는 장점을 가진다 [6-9]. 이러한 특성은 자연적인 수용체 결합을 제거하고 원하는 면역세포에 대한 표적성을 새롭게 부여하는 in vivo CAR-T용 LV 설계에 유리하게 활용될 수 있다.

그림 2. 렌티바이러스의 기본 구조와 de-targeting 및 re-targeting을 통한 T 세포 표적화 전략

2.2. 표적 전략 

VSV-G는 다양한 세포에서 광범위하게 발현되는 LDL-R 계열 수용체에 결합하여 바이러스의 세포 내 유입을 매개한다. 따라서 체내에서 T세포를 선택적으로 형질도입하기 위해서는 우선 VSV-G와 자연 수용체 간의 결합을 제거하거나 감소시키는 de-targeting 과정이 필요하다. 이러한 목적으로 LDL-R 계열 수용체와의 결합이 감소된 VSV-G 변이체(K47Q/R354Q double mutant)가 개발되었으며, 해당 변이체는 비표적 세포로의 자연적인 유입을 억제하면서 막 융합 기능을 유지하도록 설계되었다 [10].

De-targeting 된 바이러스에 T세포 선택성을 부여하기 위해서는 특정 T세포 표면분자를 인식하는 표적 결합체를 추가하는 re-targeting이 필요하다. 이를 위해 CD3, CD4, CD7 또는 CD8을 인식하는 scFv, DARPin 및 VHH 등의 결합체를 attachment protein에 직접 융합하거나 별도의 transmembrane protein 형태로 바이러스 표면에 제시하는 전략이 활용되고 있다. 또한 표적항체 또는 결합체를 교체 가능한 adaptor 모듈로 분리함으로써 동일한 fusogen에 다양한 표적 특이성을 부여하는 모듈형 플랫폼도 개발되고 있다. 이러한 설계에서는 표적 결합체가 원하는 세포에 대한 선택적 결합을 담당하는 반면, fusogen은 바이러스와 세포막의 융합을 매개한다 [8-10, 19-21]. 이처럼 수용체 인식과 막 융합 기능을 분리함으로써 자연적인 바이러스 tropism을 최소화하면서 원하는 면역세포에 선택성을 부여할 수 있다.

2.3. LV를 이용한 in vivo CAR-T 연구 동향 

초기 in vivo CAR-T 연구는 특정 T세포 아형을 선택적으로 표적 하여 체내에서 직접 CAR-T 세포를 생성하는 개념을 입증하는 데 초점을 두었다. 자연 수용체 결합이 제거된 NiV G/F 기반 입자 표면에 anti-CD8 scFv를 제시하고 anti-CD19 CAR를 전달한 연구에서는 단회 투여 후 CD8⁺ T세포에서 선택적으로 CAR 발현이 유도되었으며, 이에 따라 B세포와 lymphoma가 감소하였다 [11]. 일부 인간화 마우스에서는 cytokine release syndrome (CRS)과 유사한 염증반응도 관찰되었다. 또한 초기 reporter 형질도입률보다 후기 CAR⁺ T세포 비율이 높게 나타난 결과는 초기 유전자 전달뿐 아니라 항원 자극에 따른 CAR-T 세포의 선택적 증식이 치료 효과에 기여했음을 시사한다 [11]. 이후 modified MV H/F와 CD4-specific DARPin을 이용하여 CD4⁺ T세포를 선택적으로 공학화하는 전략이 개발되었으며, 생성된 CD4-targeted CAR-T 세포는 CD19⁺ 세포를 효과적으로 제거하고 동일 플랫폼의 CD8 표적 비교군과 비교하여 빠른 증식과 동등하거나 우수한 제거능을 나타냈다 [1, 13]. 반면 CD8 표적화에서는 CD8을 발현하는 일부 NK 및 NKT 세포에도 CAR가 전달될 수 있어, 표적 분자의 세포별 발현 범위가 최종적으로 생성되는 CAR⁺ 면역세포의 조성을 결정할 수 있음이 확인되었다 [12].

특정 T세포 아형뿐 아니라 전체 T세포 집단을 표적 하기 위한 pan-T-cell targeting 전략도 개발되었다. CD3는 대부분의 T세포에 공통적으로 발현하며, agonistic anti-CD3 scFv는 T세포 표적화와 동시에 T-cell receptor (TCR) 신호를 유도할 수 있다는 특징을 가진다. CD3-targeted LV는 별도의 사전 활성화 없이 기능성 anti-CD19 CAR-T 세포를 생성할 수 있었으나, CD3 internalization과 surface downregulation으로 인해 후속 벡터 결합 및 유전자 전달이 제한되었다 [14]. 벡터 노출 과정에서 dasatinib을 이용해 TCR signaling을 일시적으로 억제하면 표면 CD3 발현이 유지되어 유전자 전달과 CAR-T 생성이 향상되었으며, 생성된 CAR-T 세포의 종양 살상능도 보존되었다 [15, 21]. 이러한 결과는 in vivo CAR-T를 위한 표적 수용체 선정 시 세포 특이성뿐 아니라 수용체 internalization과 표적 결합에 따른 세포 활성화 정도까지 함께 고려해야 함을 보여준다.

한편 체내 환경에서는 표적 수용체와의 선택적 결합 이전에 발생하는 비특이적 벡터 제거가 전달 효율을 제한하는 중요한 요인으로 작용한다. 특히 macrophage를 포함한 골수계 세포는 혈중의 LV 입자를 포식하여 T세포에 도달하는 유효 입자 수를 감소시키는 vector sink로 작용할 수 있다. Myeloid cell이 풍부한 NSG-SGM3 인간화 마우스에서는 CD4- 및 CD8-targeted LV 투여 후 CAR-T 세포 생성과 B-cell 감소가 유도되었지만, 일반적인 인간화 마우스에 비해 형질도입 효율이 낮았다 [16]. 반면 생산세포와 벡터 표면의 면역학적 특성을 조절하여 비특이적 제거를 감소시켰을 때 전달 효율이 개선되었다 [16, 21]. 이는 in vivo LV의 성능이 표적 결합체의 선택성뿐 아니라 혈중 안정성, 선천면역계에 의한 인식 및 비특이적 포식 회피 능력에도 좌우됨을 보여준다.

이러한 초기 연구를 바탕으로 최근에는 단순한 T세포 표적화를 넘어 표적화, 활성화, 공동자극 및 증식 조절 기능을 하나의 벡터 시스템에 통합하는 방향으로 플랫폼이 고도화되고 있다. Cocal envelope 기반 VivoVec는 anti-CD3 scFv를 이용하여 T세포를 표적화하고 활성화하는 동시에 anti-CD19 CAR와 rapamycin-activated cytokine receptor (RACR)를 함께 전달하여 약물 의존적으로 CAR-T 세포의 증식을 조절하도록 설계되었다 [17]. 후속 Advanced VivoVec에서는 CD58-anti-CD3-CD80 multidomain ligand를 벡터 표면에 도입하여 T세포와의 접착, TCR 자극 및 공동자극 기능을 통합하였으며, 인간화 마우스와 비인간 영장류에서 강력한 CAR-T 세포 생성과 장기간의 B-cell depletion을 유도하였다 [18].

유사하게, 표적화와 T세포 활성화 기능을 벡터 표면에 동시에 구현하는 모듈형 플랫폼도 개발되고 있다. Engineered Sindbis envelope 기반 enSLV-T는 자연 수용체 결합이 제거된 외피에 protein A 유래 ZZ domain을 삽입하고, 이를 통해 anti-CD3 및 anti-CD28 항체를 모듈식으로 장착하도록 설계되었다 [25]. PBMC-humanized NPG 마우스에서 반복 정맥 투여 후 T세포 선택적인 CAR 생성, lymphoma 억제 및 생존 연장이 확인되었다. 다만 혈청 존재 조건에서의 전달 효율 감소, donor 간 전달 효율의 차이 및 반복 투여의 필요성은 향후 개선이 필요한 과제로 남아 있다. MeV/DMV chimeric envelope 기반 TaSEL 역시 anti-CD7 VHH를 이용해 T세포를 re-targeting 하는 동시에 입자 표면의 anti-CD3와 CD80을 통해 활성화 및 공동자극 신호를 제공하도록 설계되었다 [24]. 특히 DMV 유래 외피 영역을 활용하여 measles 백신으로 형성된 기존 중화항체의 영향을 감소시키고자 하였으며, 단회 투여 후 전임상 모델에서 높은 T세포 선택성, 간세포로의 off-target 전달 감소 및 종양 억제 효과가 확인되었다. 이러한 연구들은 최근 in vivo LV 플랫폼이 단순한 세포 표적화를 넘어 T세포 활성화와 공동자극, 기존 면역 회피 기능까지 통합하는 방향으로 발전하고 있음을 보여준다.

이와 함께 벡터의 생산성과 안전성을 높이기 위한 설계도 병행되고 있다. Mixed NiV envelope, fourth-generation lentiviral backbone 및 TRiP 시스템을 결합한 TetraVecta는 CAR를 포함한 transgene이 생산세포에서 발현되는 것을 억제하도록 설계되었다 [19]. TRiP은 벡터 생산 과정에서 CAR 단백질이 입자 표면에 비의도적으로 탑재되는 현상을 감소시켰으며, 최적화된 CD3- 또는 CD8-targeted LV는 체내에서 기능성 CAR-T 세포 생성과 B-cell depletion을 유도하였다. 이는 in vivo CAR-T용 LV 개발이 체내 표적성과 전달 효율의 개선뿐 아니라 벡터 제조 단계에서 발생할 수 있는 비의도적 단백질 발현과 off-target 위험까지 함께 최소화하는 방향으로 확장되고 있음을 보여준다.

렌티바이러스를 이용한 주요 in vivo CAR 면역세포 공학 전략은 표 2에 정리하였다.

표 2. 렌티바이러스 기반 in vivo CAR 면역세포 생성 전략

2.4. EDV-AAV 

LV envelope engineering을 통해 체내 T세포 선택성을 향상시킬 수 있지만, LV를 통해 전달된 CAR transgene이 숙주 유전체의 예측하기 어려운 위치에 통합될 수 있다는 한계는 여전히 남아 있다. 이러한 한계를 보완하기 위해 enveloped delivery vehicle (EDV)을 이용하여 유전체 편집 도구를 T세포에 선택적으로 전달하는 전략이 개발되었다. EDV는 자연적인 LDL-R 결합이 제거된 VSV-G 변이 fusogen과 T세포 표적 scFv를 이용하여 CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein (RNP)을 표적 T세포에 전달하도록 설계되었다 [22]. 인간화 마우스에서 CAR 전달과 TRAC 유전자 편집이 동시에 이루어졌으나, 이 전략에서도 CAR transgene 자체는 LV 유전체를 통해 반무작위적으로 통합되기 때문에 위치 특이적인 CAR 삽입이라는 문제를 완전히 해결하지는 못하였다.

이후 이러한 한계를 극복하기 위해 EDV와 adeno-associated virus (AAV)를 결합한 이중 전달 전략이 제시되었다 [23]. 이 시스템에서는 EDV가 TRAC locus를 표적 하는 Cas9 RNP를 전달하고, AAV6가 promoterless CAR donor template를 제공하여 homology-directed repair (HDR)를 통해 CAR transgene을 TRAC locus에 선택적으로 knock-in 하도록 설계되었다. 인간화 마우스에서 CD19 CAR를 이용한 B-cell depletion과 B7-H3 CAR를 이용한 고형암 억제 효과가 확인되었으며, 이를 통해 체내에서 안정적인 CAR 발현과 transgene의 통합 위치 제어를 동시에 구현할 가능성이 제시되었다. 다만 동일한 T세포에 EDV와 AAV가 모두 전달되어야 한다는 점과 제한적인 HDR 효율, AAV에 대한 기존 중화항체, 그리고 이중 벡터 생산에 따른 제조 복잡성은 향후 해결해야 할 과제로 남아 있다 [23].

3. 지질 나노입자

mRNA 전달 기술은 원하는 단백질의 염기서열만 확보하면 신속하게 설계할 수 있는 유연한 치료 및 백신 플랫폼이다. 그러나 mRNA는 자체적으로 불안정하고 체내 RNase에 의해 쉽게 분해되며, 큰 음전하를 띠기 때문에 세포막을 직접 통과하기 어렵다는 한계를 가진다 [26]. 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP)는 이온화 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 PEG-지질 등으로 구성된 전달체로, mRNA를 외부 분해로부터 보호하고 세포 내 유입을 촉진한다 [26, 27]. 특히 이온화 지질은 생리적 pH에서는 비교적 중성을 유지하여 독성을 낮추는 반면, 엔도솜의 산성 환경에서는 양전하를 띠어 엔도솜 막과의 상호작용 및 mRNA의 세포질 방출을 촉진한다 [27].

COVID-19 팬데믹을 통해 LNP-mRNA 백신이 대규모로 개발·생산·투여되면서, LNP-mRNA 플랫폼은 신속한 설계와 제조 확장성 및 임상 적용 가능성을 입증하였다 [27, 28]. 이러한 경험을 바탕으로 최근에는 LNP-mRNA 기술을 이용하여 체내 T세포를 직접 유전적으로 조작하는 in vivo CAR-T 치료 전략이 활발하게 연구되고 있다 [29, 30]. CAR mRNA는 세포질에서 일시적으로 발현되고 숙주 유전체에 삽입되지 않으므로 삽입 돌연변이(insertional mutagenesis)의 위험을 피할 수 있다는 장점이 있다. 또한 제한적인 발현 기간은 cytokine release syndrome (CRS) 및 on-target/off-tumor 독성의 위험을 줄이는 데 기여할 수 있으며, 반복 투여를 통해 CAR 발현의 강도와 지속 기간을 조절할 수 있다 [29, 30].

3.1. LNP의 공학적 설계 원리 

정맥 투여된 LNP는 혈중에서 apolipoprotein E (ApoE)와 같은 단백질을 흡착한 후 간세포의 LDL 수용체 계열을 통해 흡수되어 간 친화성(liver tropism)을 나타내는 경향이 있다 [31]. 따라서 간으로의 비표적 전달을 줄이고 비장·림프절 등 림프계 조직으로의 분포, 엔도솜 탈출 및 생체적합성을 조절하기 위해 LNP 조성 공학(LNP composition engineering)이 활용된다 [30, 34, 35, 43]. 이온화 지질의 머리 부분과 꼬리 부분의 구조, pKa 및 생분해성은 mRNA 포집과 엔도솜 막 교란 능력에 영향을 미치며 [27, 30, 34], 인지질과 콜레스테롤은 입자의 구조적 안정성과 막 상호작용에 기여한다 [27, 43]. 또한 PEG-지질의 종류와 함량은 입자 크기, 혈중 순환 및 단백질 코로나 형성에 영향을 미친다 [27].

그러나 LNP가 간 외 조직에 도달하더라도 혈액과 림프계에 존재하는 다양한 면역세포 중 T세포에 선택적으로 결합하고 세포 내로 유입되어야 한다. 이를 위해 LNP 표면에 표적 리간드(binder)를 부여하는 표면 공학(surface engineering)이 활용된다 [29, 30, 32, 33]. Anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5, anti-CD7 또는 anti-CD8 항체와 같은 binder를 LNP 표면에 결합하면 전체 T세포 또는 특정 T세포 아형을 선택적으로 표적 할 수 있으며 [29, 30, 32, 33], full-size 항체뿐 아니라 Fab과 같은 항체 절편도 활용될 수 있다 [35]. 표적 수용체마다 T세포 표면의 발현 수준, 내재화 속도 및 세포 활성화 유도 정도가 서로 다르기 때문에 표적 수용체의 선택은 전달 효율에 직접적인 영향을 미칠 수 있다 [33]. 또한 서로 다른 수용체를 동시에 인식하는 다중 표적화 전략과 [33], 표적 항체에 공동자극 수용체 작용제 또는 사이토카인을 함께 제시하여 T세포의 결합, 유입 및 기능을 동시에 조절하는 전략도 개발되고 있다 [42].

T세포에 유입된 LNP는 엔도솜으로부터 탈출하여 CAR mRNA를 세포질로 방출해야 하며, 방출된 mRNA는 필요한 수준과 기간 동안 안정적으로 번역되어야 한다 [27]. 이러한 전달 이후의 발현 특성을 최적화하기 위해 RNA 페이로드 공학(RNA payload engineering)이 활용된다. 5′ cap, poly(A) tail, 5′/3′ 비번역 부위(untranslated region, UTR), 코돈 최적화 및 변형 뉴클레오사이드 등은 RNA 안정성과 번역 효율을 높이는 데 활용된다 [27]. 또한 원형 RNA (circular RNA, circRNA)는 선형 mRNA보다 분해에 상대적으로 강한 특성을 가지므로 CAR 발현 지속 시간을 연장하기 위한 새로운 RNA 페이로드로 연구되고 있다 [36].

3.2. LNP 조성 공학 

면역세포를 표적으로 하는 LNP에서는 높은 발현량뿐 아니라 간으로의 비표적 전달과 지질의 장기 잔류를 줄이는 것도 중요한 설계 목표이다. 이를 위해 개발된 L829-LNP는 비표적 조건에서 ALC-0315 기반 benchmark LNP보다 간과 비장 모두에서 낮은 luciferase 발현을 보였다. 여기에 CD5 표적화를 적용한 CD5-L829 tLNP는 간의 비표적 발현을 증가시키지 않으면서 비장 선택적 발현을 나타냈다. 또한 LC-MS 분석에서 L829는 간에서 빠르게 감소한 반면, ALC-0315는 최소 7일 동안 높은 수준으로 잔류하였다. 이는 이온화 지질의 구조 설계가 표적 항체와 결합하여 장기 수준의 발현 분포와 간 내 잔류를 조절할 수 있음을 보여준다 [30].

이러한 장기 수준의 분포와 잔류 특성뿐 아니라, LNP 자체의 내재적 형질주입 능력도 T세포 전달 효율을 결정하는 중요한 요소이다. 비장 친화성을 보이는 LNP에 CD3 표적화를 적용하여 비교한 결과, citronellol을 소수성 꼬리로 갖는 H3T4 이온화 지질 기반 LNP는 대조군 LNP보다 약 3~4배 높은 비장 T세포 형질주입 효율을 나타냈다. Citronellol 꼬리의 분지 구조와 이중결합이 엔도솜 막의 교란을 촉진하여 mRNA의 세포질 방출을 향상시키는 것으로 해석되었다. 이는 효율적인 T세포 형질주입을 위해서는 장기 선택성과 더불어 세포 내 전달 능력이 함께 최적화되어야 함을 보여준다 [34] (표 3).

LNP의 형질주입 효율과 mRNA 발현을 향상시키기 위한 조성 최적화도 이루어지고 있다. 콜레스테롤 일부를 β-sitosterol로 치환한 LNP는 293T 세포, 섬유아세포 및 정상 간세포를 이용한 체외 실험에서 기존 LNP보다 높은 luciferase 발현을 나타냈다. 여기에 CD5 항체를 결합한 LNP는 비표적 LNP보다 T세포에서 높은 발현 효율을 나타냈으며, FAP CAR mRNA를 탑재했을 때 비장과 폐의 T세포에서 일시적인 FAP CAR-T 세포를 생성하였다. 또한 폐섬유화 마우스 모델에서 FAP⁺ 활성화 섬유아세포와 collagen 축적을 감소시키고 폐섬유화를 완화하였다 [43].

한편 일부 LNP는 별도의 항체 표적화 없이도 T세포 전달 효율을 확보할 가능성을 보여주었다. 카디오리핀 구조를 모방한 CAMP 이온화 지질 중 PL40은, 사람 일차 T세포를 이용한 체외 실험에서 ALC-0315 기반 LNP보다 약 100배 높은 mRNA 발현과 80% 이상의 GFP⁺ T세포를 유도하였다. 체내에서는 LNP 입자 분포가 간과 비장 모두에서 확인되었지만, mRNA 발현은 간보다 비장에서 우세했으며 혈액·림프절·비장의 T세포에서 주로 관찰되었다. 이는 T세포 전달에 유리한 이온화 지질을 통해 LNP의 T세포 전달 선택성을 높일 수 있음을 시사한다 [35].

3.3. T 세포 표적화 공학 

초기 연구에서는 CD4⁺ T세포를 선택적으로 표적 하기 위해 LNP 표면에 anti-CD4 항체를 결합하였다. 해당 LNP는 마우스에서 비장과 림프절의 CD4⁺ T세포에 mRNA를 우선적으로 전달하였으며, Cre recombinase mRNA를 탑재했을 때 loxP 매개 reporter 유전자 발현을 유도하였다. 이는 LNP를 통해 전달된 mRNA가 표적 T세포 내부에서 기능적으로 번역될 수 있음을 보여주었으며, 항체가 결합된 LNP를 이용하여 체내 특정 T세포 아형에 mRNA를 선택적으로 전달할 수 있다는 가능성을 제시하였다 [32].

이후 전체 T세포를 표적 하기 위해 pan-T-cell marker인 CD3, CD5 및 CD7을 표적으로 선정하고 각 수용체에 따른 전달 효율과 안전성을 비교하는 연구가 수행되었다. 연구진은 간 외 조직 친화성(extrahepatic tropism)을 갖는 LNP에 각각의 표적 항체를 결합한 antibody-conjugated LNP(Ab-LNP)를 설계하여 간 축적을 줄이는 동시에 T세포 선택적 전달을 유도하고자 하였다. 체내 평가 결과 비표적 LNP만으로는 충분한 T세포 형질주입이 어려웠으며, 효율적인 T세포 mRNA 전달을 위해 항체 기반 표적화가 필요한 것으로 나타났다. 이 가운데 CD3 표적 LNP는 가장 높은 전달 효율과 CAR 기능을 나타냈으나, T세포 감소와 사이토카인 증가가 함께 관찰되어 안전성 측면의 부담이 나타났다 [29]. CD7 표적 LNP는 CD3 표적 LNP보다 전달 효율은 낮았으나 상대적으로 완만한 면역반응과 함께 기능성 CAR-T 세포를 생성하였다. 반면 CD5 표적화는 유의미한 수준의 T세포 형질주입을 유도하지 못하였다 [29].

다양한 연구에서 여러 T세포 표면 수용체를 표적 하는 LNP가 in vivo CAR-T 생성에 활용되면서 표적 수용체에 따른 전달 효율의 차이가 관찰되었으나, 이를 결정하는 기전은 명확하지 않았다. 이에 CD2, CD4, CD5, CD7 및 CD8을 각각 표적 하는 LNP를 동일한 조건에서 비교하여 T세포 표지자별 전달 효율을 결정하는 요인을 분석한 연구가 수행되었다. 그 결과 CD7 표적 LNP가 가장 높은 mRNA 전달 효율을 보였으며, 사람 T세포와 인간화 마우스에서 기능성 CAR-T 세포 생성을 유도하였다. 전달 효율은 표면 수용체의 발현량과 단순히 비례하지 않았으며, LNP가 수용체에 결합한 후 해당 수용체가 얼마나 빠르게 세포 내로 내재화되는지가 중요한 결정 요인으로 확인되었다. 따라서 이 연구는 T세포 표적 LNP의 binder를 선정할 때 수용체의 발현량뿐 아니라 내재화 특성을 함께 고려해야 한다는 합리적인 설계 기준을 제시하였다 [33].

최근에는 T세포 표지자를 인식하는 항체를 단순히 결합하는 것을 넘어, LNP 표면에 T세포 활성화와 증식을 조절하는 신호를 함께 제시하여 전달 효율과 기능을 동시에 향상시키려는 전략도 개발되고 있다. Anti-CD3 및 anti-CD28 항체에 IL-7을 추가로 결합한 LNP는 T세포-LNP 접점에서 TCR 자극, 공동자극 및 사이토카인 신호를 동시에 제공하도록 설계되었다. 이 플랫폼은 항체만 결합한 LNP 또는 동일한 양의 가용성 IL-7을 함께 처리한 조건보다 사람 T세포에서 입자 흡수와 mRNA 발현을 증가시켰으며, 체내에서는 기능적 mRNA 전달을 비장 T세포 쪽으로 유도하면서 간 T세포에서의 발현은 감소시켰다. 또한 CAR mRNA를 탑재한 경우 기능성 CAR 발현 T세포를 생성하여 항원 특이적인 표적세포 제거를 유도하였다. 이러한 결과는 LNP 표면 공학이 단순한 세포 선택적 결합을 넘어 T세포의 활성화 상태와 mRNA 발현 환경까지 함께 조절하는 방향으로 확장되고 있음을 보여준다 [42].

3.4. RNA 페이로드 공학 

RNA 서열을 최적화하여 CAR 발현과 기능을 향상시키기 위한 전략도 개발되고 있다. 두 종류의 anti-CD19 CAR 구조를 기반으로 5′/3′ UTR 조합과 코돈 사용을 다양화하고 발현을 저해할 수 있는 서열 특징을 제거한 mRNA 후보군이 제작되었다. 이 가운데 최적화된 CAR2 mRNA를 L829 기반 CD8 표적 tLNP에 탑재하여 인간화 마우스에 투여한 결과, 기존 CAR2 mRNA보다 T세포에서 높은 CAR 발현을 유도하였다. 이는 동일한 전달체와 표적화 전략을 사용하더라도 mRNA의 UTR 및 코돈 사용을 포함한 서열 설계에 따라 체내 CAR 발현 효율이 달라질 수 있음을 보여준다 [30].

한편 RNA의 구조 자체를 변경하여 CAR 발현의 지속 시간을 연장하려는 전략도 연구되고 있다. 원형 RNA (circular RNA, circRNA)는 5′ 및 3′ 말단이 공유결합으로 연결된 고리형 RNA로, exonuclease가 인식할 수 있는 자유 말단이 없어 선형 mRNA보다 분해에 상대적으로 강하다. 다만 일반적인 cap-dependent translation initiation이 불가능하기 때문에 internal ribosome entry site(IRES)와 같은 cap-independent translation 요소를 이용하여 단백질 발현을 유도한다 [36].

CircRNA의 면역원성과 발현 지속성을 분석한 연구에서는 고순도로 정제된 circRNA가 선형 mRNA보다 RIG-I 및 Toll-like receptor (TLR) 매개 선천면역반응을 적게 유도하였으며, 나노입자로 전달했을 때 마우스 지방조직에서 비변형 및 uridine 변형 선형 mRNA보다 단백질 발현을 더 오래 유지하였다. 반면 원형화 과정에서 잔류한 선형 RNA는 강한 면역반응을 유발하였으며, 이는 circRNA의 면역자극성과 발현 지속성이 원형 구조 자체뿐 아니라 RNA의 순도와 정제 과정에도 영향을 받음을 보여준다. 이러한 결과는 circRNA가 장기간 단백질 발현을 유도할 수 있는 유망한 RNA 페이로드임을 제시하였다 [36].

이러한 circRNA의 특성을 실제 in vivo CAR-T에 적용한 연구에서는 카디오리핀 모방 phosphoramide (CAMP) 이온화 지질인 PL40에 CAR를 암호화하는 circRNA를 탑재하였다. PL40-circRNA는 동일한 LNP에 선형 mRNA를 탑재한 경우보다 비장에서 더 높은 초기 발현과 연장된 발현 지속 시간을 나타냈으며, 비장 우세의 체내 분포 역시 유지하였다. 따라서 circRNA는 유전체에 통합되지 않는 RNA 기반 전달의 장점을 유지하면서도 CAR 발현의 강도와 지속 시간을 향상시킬 수 있는 RNA 페이로드 전략으로 활용될 가능성을 보여준다 [35].

표 3. LNP 기반 in vivo CAR-T 생성 전략 및 전임상 결과 

그림 3. In vivo CAR-T 생성을 위한 LNP의 구성요소별 공학 전략

표 4. In vivo CAR-T 바이러스 및 LNP 전달체의 특성 비교

4. In vivo CAR-T 바이러스 전달체의 한계 및 극복 전략 

앞서 논의한 바와 같이, 바이러스 기반 in vivo CAR-T는 렌티바이러스(lentivirus, LV)와 adeno-associated virus (AAV) 등의 바이러스 전달체를 활용하여 체내에서 직접 CAR-T 세포를 생성하거나 유전체 편집을 통해 CAR 유전자를 도입하는 전략이다. 전달 효율과 안전성을 향상시키기 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있으며, LV는 숙주 유전체에 통합되어 장기간 안정적인 CAR 발현을 유도할 수 있다는 장점을 가진다. 반면 AAV는 상대적으로 유전체 통합 빈도가 낮고, 유전체 편집 기술과 결합하여 위치 특이적인 CAR 삽입을 위한 donor template 전달 등에 활용될 수 있다. 최근에는 체내 전달의 정밀성과 기능성을 향상시키고 유전체 삽입 위치를 보다 정밀하게 제어하기 위한 차세대 플랫폼 기술이 개발되면서, 바이러스 전달체를 이용한 in vivo CAR-T의 임상 적용 가능성이 확대되고 있다 (표 4).

4.1. In vivo CAR-T 바이러스 전달체의 한계 

지속적인 발전에도 불구하고 바이러스 기반 in vivo CAR-T는 전달 효율, 면역반응 및 안전성 측면에서 여전히 해결해야 할 과제를 가지고 있다 [3, 44]. 이러한 주요 한계와 관련 극복 전략은 표 5에 정리하였다.

기술적 측면에서는 복잡한 체내 환경 내 표적 T세포에 충분한 양의 바이러스 전달체를 선택적으로 전달하여 치료 효과를 나타낼 수 있는 수준의 CAR-T 세포를 생성하는 것이 중요하다. 체내에서는 중화항체, 비표적 세포에 의한 포획 및 면역세포에 의한 제거 등으로 인해 표적 T세포에 도달하는 유효 바이러스 입자의 수가 감소할 수 있으며 [1, 2, 21], 휴지기(resting) T세포의 특성 역시 효율적인 형질도입을 제한하는 요인으로 작용할 수 있다. 또한 AAV는 전달된 유전물질이 주로 episomal 형태로 존재하기 때문에 세포 분열 과정에서 희석될 수 있으며, 기존에 존재하거나 반복 투여 후 형성된 AAV 중화항체는 재투여 효율을 제한하는 요인이 될 수 있다 [3, 44].

안전성 측면에서는 유전체 삽입, 비표적 세포의 형질도입 및 지속적인 CAR 발현에 따른 위험을 고려해야 한다. LV는 숙주 유전체에 통합되는 특성으로 인해 유전자 발현 교란 및 삽입 돌연변이(insertional mutagenesis)의 잠재적 위험을 가지며, AAV 역시 빈도는 낮지만 유전체 삽입의 가능성을 완전히 배제할 수 없다. 또한 표적 선택성이 충분하지 않을 경우 비표적 세포에서도 CAR가 발현될 가능성이 있다. 이와 함께 체내에서 생성된 CAR-T 세포의 과도하거나 지속적인 활성에 따른 Cytokine release syndrome (CRS), Immune effector cell-associated neuro-toxicity syndrome (ICANS) 및 B-cell aplasia 등의 독성 역시 주요 안전성 과제로 남아 있다 [1-3, 44].

4.2. In vivo CAR-T 바이러스 전달체의 극복 전략 

이러한 한계를 극복하기 위해 체내 면역반응과 바이러스 입자의 비특이적 제거를 감소시키고, 표적 T세포에 대한 전달 선택성과 효율을 향상시키기 위한 다양한 기술이 개발되고 있다 [17-20, 24, 25]. 바이러스 외피와 표면 특성을 조절하여 체내 안정성을 증가시키고, 자연 수용체에 대한 결합을 감소시키는 de-targeting과 T세포 특이적 binder를 이용한 re-targeting을 통해 비표적 세포로의 전달을 최소화하는 전략이 활용되고 있다. 또한 T세포 특이적인 유전자 발현 조절을 통해 비표적 세포에서의 CAR 발현을 억제하는 접근도 연구되고 있다 [3].

표 5. In vivo CAR-T 바이러스 전달체의 한계 및 극복 전략

5. In vivo CAR-T LNP의 한계 및 극복 전략 

LNP 기반 In vivo CAR-T는 체내 T세포에 유전 정보를 직접 전달하여 일시적인 CAR 발현을 유도하는 비바이러스성 접근법이다. 이 전달체의 성능은 T세포 표적화, LNP의 체내 분포와 세포 내 유입, 그리고 RNA 페이로드의 발현 특성이 유기적으로 최적화될 때 향상될 수 있다. 최근에는 이러한 요소를 통합적으로 조절하여 전달 효율과 치료 효과를 높이는 동시에 반복 투여에 따른 안전성 문제를 최소화하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다 [30, 33-35] (표 4).

5.1. In vivo CAR-T LNP의 한계 

LNP 기반 in vivo CAR-T 역시 전달 효율, 치료 지속성, 면역반응 및 안전성 측면에서 해결해야 할 여러 과제를 가지고 있다. 이러한 주요 한계와 관련 극복 전략은 표 6에 정리하였다.

기술적 측면에서는 표적 T세포에 충분한 양의 유전 정보를 전달하고 필요한 수준의 CAR 발현을 확보하는 것이 중요하다. 그러나 T세포로의 전달 효율은 표적 수용체의 내재화(internalization), LNP의 세포 내 유입 및 엔도솜 탈출(endosomal escape)과 같은 여러 단계에 의해 제한될 수 있다. 또한 혈중 단백질과의 상호작용 및 protein corona 형성은 LNP의 체내 분포를 변화시키고 간과 같은 비표적 조직으로의 축적을 증가시킬 수 있다 [3]. mRNA-LNP는 CAR가 일시적으로 발현되기 때문에 치료 목적과 발현 기간에 따른 반복 투여가 필요할 수 있으며, 이 과정에서 유발되는 면역반응은 후속 투여의 전달 효율과 내약성에 영향을 미칠 가능성이 있다. 또한 표적 ligand의 안정적인 결합, 입자의 균일성 및 장기간 보관 안정성을 동시에 확보해야 한다는 점도 제조 및 품질관리 측면의 과제로 남아 있다 [2, 3].

안전성 측면에서는 반복 투여에 따른 면역 활성화와 비표적 세포로의 전달을 고려해야 한다. LNP를 구성하는 지질 성분이나 표면에 결합된 표적 ligand는 선천면역 또는 적응면역 반응을 유발할 수 있으며, macrophage와 monocyte 등의 식세포에 의한 비특이적 제거는 표적 T세포로의 전달 효율을 감소시킬 수 있다. 또한 표적 선택성이 충분하지 않을 경우 비표적 세포에서 CAR가 발현될 가능성도 존재한다. DNA를 페이로드로 사용하는 LNP의 경우에는 유전체에 장기간 존재하거나 삽입될 가능성을 고려해야 하므로, 일시적 발현을 유도하는 mRNA-LNP와는 다른 장기 안전성 평가가 요구된다 [2, 3].

5.2. In vivo CAR-T LNP의 극복 전략

이러한 기술적·안전성 문제를 극복하기 위해 표적 T세포로의 전달 효율을 높이는 동시에 간으로의 비표적 분포와 반복 투여에 따른 면역반응을 감소시키기 위한 다양한 공학적 전략이 개발되고 있다. T세포에서 효율적으로 내재화되는 수용체를 표적으로 하는 항체 또는 항체 단편을 LNP 표면에 도입함으로써 세포 선택성과 세포 내 유입을 향상시킬 수 있으며, 이온화 지질을 포함한 LNP 조성과 표면 표적화 전략을 함께 최적화하여 체내 분포와 T세포 전달 효율을 조절하는 접근이 활용되고 있다 [3, 30, 33, 34].

이와 함께 LNP의 체내 안정성과 반복 투여 가능성을 개선하기 위한 전략도 연구되고 있다. 투여 방식과 투여 간격을 최적화하거나 선행 처치를 통해 과도한 면역 활성화를 줄이는 접근이 고려되고 있으며 [3, 30], CD47과 같은 ‘don't-eat-me’ 신호를 입자 표면에 도입하여 식세포에 의한 비특이적 제거를 감소시키려는 전략도 제시되고 있다. 또한 비표적 조직에서의 유전자 발현을 억제하기 위해 DNA-LNP에서는 T세포 특이적 promoter를 활용하고, mRNA-LNP에서는 조직 특이적 microRNA에 의해 인식되는 서열을 도입하는 post-transcriptional regulation 전략이 활용될 수 있다 [3]. 이러한 접근은 LNP의 체내 분포뿐 아니라 유전자 발현 수준에서도 세포 선택성을 확보함으로써 in vivo CAR-T의 전달 효율과 안전성을 동시에 향상시키는 것을 목표로 한다.

표 6. In vivo CAR-T LNP의 주요 한계 및 극복 전략

6. In vivo CAR-T의 치료 전망 

In vivo CAR-T 세포 치료는 바이러스 벡터 또는 지질 나노입자(LNP)를 이용하여 체내 면역세포에 CAR 유전자를 직접 전달함으로써, 기존 ex vivo CAR-T 치료의 복잡한 제조 과정과 높은 비용 및 제한된 접근성을 극복하고자 하는 차세대 면역세포 치료 전략이다 [1, 2]. 바이러스 전달체는 장기간 안정적인 CAR 발현에 유리한 반면, mRNA-LNP는 일시적이고 반복 조절이 가능한 CAR 발현을 유도할 수 있어 두 플랫폼은 각각 치료 지속성과 안전성 측면에서 상호보완적인 특성을 가진다 [3].

In vivo CAR-T의 임상 도입을 위해서는 체내 면역반응, 비의도적 유전자 전달 및 삽입 돌연변이의 위험을 최소화하고, 표적 면역세포에 대한 높은 전달 선택성과 정밀한 유전자 발현 조절을 확보해야 한다. 또한 체내에서 생성되는 CAR-T 세포의 수와 활성 및 지속성을 예측하고 조절할 수 있어야 하며, 반복 투여 가능성과 장기 안전성도 함께 검증되어야 한다. 이와 더불어 바이러스 벡터와 LNP의 균일한 품질을 유지하면서 대규모로 생산할 수 있는 제조공정과 품질관리 체계를 확립하는 것 역시 임상 전환을 위한 중요한 과제로 남아 있다 [2, 3].

최근에는 단순히 체내에서 CAR-T 세포를 생성하는 것을 넘어, 생성된 세포의 기능과 지속성을 향상시키기 위한 다층적 엔지니어링 전략도 연구되고 있다. 사이토카인 또는 면역조절 인자를 발현하는 armored CAR 설계, 공동자극 신호의 최적화 및 합성 수용체를 이용한 세포 기능 재프로그래밍 등은 CAR-T 세포의 증식과 지속성 및 항종양 활성을 강화하는 데 활용될 수 있다 [44]. 다만 이러한 기능 강화는 과도한 면역 활성화와 전신 독성을 증가시킬 가능성도 있으므로, 치료 유전자의 발현 수준과 지속 기간을 정밀하게 제어할 수 있는 전달 및 안전성 조절 기술과 함께 개발되어야 한다.

In vivo CAR-T의 적용 범위는 혈액암뿐 아니라 고형암과 자가면역질환으로도 확대되고 있다. 고형암에서는 종양 조직으로의 접근성, 면역억제성 종양미세환경 및 종양항원의 이질성을 극복하기 위한 기술이 요구된다 [44]. 한편 자가면역질환에서는 CD19 또는 BCMA를 표적으로 병원성 B세포나 항체 생성 세포를 제거하는 전략이 연구되고 있으며, 체내에서 CAR-T 세포를 직접 생성하는 접근은 복잡한 환자 맞춤형 제조 없이 치료를 제공할 가능성을 제시한다 [45]. 다만 환자의 T세포 수와 기능적 상태에 따라 치료 효능이 제한될 수 있으므로, 환자의 면역 상태와 질환 특성을 고려한 적절한 대상 환자 선정이 중요하다 [3].

결론적으로, in vivo CAR-T 세포 치료는 아직 전달 효율, 세포 선택성, 면역독성, 유전체 안전성 및 제조 측면에서 해결해야 할 과제를 안고 있다. 그러나 표적 전달체, 유전체 편집, RNA 페이로드 및 면역세포 기능 조절 기술의 발전을 통해 기존 ex vivo CAR-T 치료의 한계를 보완할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 향후 각 전달체의 특성에 적합한 치료 적응증과 투여 전략을 확립하고 장기적인 안전성과 유효성을 입증한다면, in vivo CAR-T는 혈액암을 넘어 고형암과 자가면역질환 등 다양한 난치성 질환에 적용될 수 있는 새로운 면역세포 치료 전략으로 발전하게 될 것이다.

[AI 도구 활용 내역] OpenAI. (2026), ChatGPT (GPT-5 기반 모델, 활용일자: 2026.08.01.~2026.08.14.). 본 동향리포트 작성 과정에서 관련 문헌 검색 및 문장 교정에 활용하였습니다. 최종 내용은 저자가 확인 및 검토 후 수정하였습니다.

7. 참고문헌

==>첨부파일(PDF) 참조