목 차 

1. 서론
  1.1. 학회 개요
  1.2. 학회 전반에서 관찰된 핵심 연구의 흐름
  1.3. 학회 구성 및 공동 개최의 의의
2. 본론
  2.1. Keynote Session (Joint)
    2.1.1. Jennifer A. Doudna, HHMI/University of California, Berkeley
  2.2. Session - Delivery (Joint)
    2.2.1. Daniel J. Siegwart, University of Texas Southwestern Medical Center
    2.2.2. Anastasia Khvorova, RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School
    2.2.3. Leah R Sabin, Regeneron Pharmaceuticals
  2.3. Session - New Editing Modality
    2.3.1. Samuel H Sternberg, Columbia University
    2.3.2. Cecilia Cotta-Ramusino, Tessera Therapeutics
    2.3.3. Erik J Sontheimer, University of Massachusetts Medical School
    2.3.4. Shannon M Miller, Scripps Research
    2.3.5. Liam J Bartie, Arc Institute / University of California, Berkeley
  2.4. Session - Intersection of Gene Editing High Throughput Screening and Machine Learning
    2.4.1. Hyongbum Henry Kim, Yonsei University College of Medicine
    2.4.2. Jonathan S. Weissman, Whitehead Institute, HHMI, and MIT
    2.4.3. Randall J. Platt, ETH Zurich
    2.4.4. Shengdar Q Tsai, St. Jude Children's Research Hospital
    2.4.5. Dowoon Gu, Korea University
  2.5. Session - Therapeutic Application
    2.5.1. Yuxuan Wu, YolTech Therapeutics
    2.5.2. Micah Benson, KSQ Therapeutics
    2.5.3. Sarah Pierce, Broad Institute
    2.5.4. Haihua Chu, Beam Therapeutics
    2.5.5. Luigi M Naldini, San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy
    2.5.6. X. Shawn Liu, Columbia University Medical Center
  2.6. Session - New Editing Modality and Therapeutics
    2.6.1. Phoebe A Rice, University of Chicago
    2.6.2. Sébastien Levesque, Boston Children's Hospital - Harvard Medical School
    2.6.3. Holt A Sakai, Broad Institute
    2.6.4. Lilly van de Venn, ETH Zurich
  2.7. Session - CRISPR Biology
    2.7.1. Joseph Bondy-Denomy, University of California, San Francisco
    2.7.2. Mitchell R. O'Connell, University of Rochester Medical Center
    2.7.3. Elizabeth Kellogg, St. Jude Children's Research Hospital
  2.8. 네트워킹 프로그램
    2.8.1. Social Night
    2.8.2. Poster Session
    2.8.3. Carrer Roundtable (Joint)
3. 총평
4. 참고문헌


1. 서론

1.1. 학회 개요

Keystone Symposia는 특정 연구 주제를 좁고 깊게 다루는 워크숍형 국제 학술회의로 잘 알려져 있다. 이번 학회는 Precision Genome Engineering 분과와 Nucleic Acid Therapeutics and Targeted Delivery 분과가 공동 개최되었으며, 정밀 유전체 편집과 핵산 치료제 분야가 공통적으로 직면한 핵심 과제인 표적 세포 선택성, 전달 효율, 편집 정확도, 치료 적용의 확장을 중심 화두로 다루었다. 또한 이러한 혁신의 배경이 되는 자연계의 새로운 유전자 편집기를 탐색하고, 그 작동 메커니즘을 이해하려는 기초 연구 역시 비중 있게 조명되었다.

한편 Keystone Symposia 특유의 밀도 높은 구성 덕분에, 발표 세션뿐 아니라 연구자 간의 좁고 깊은 네트워킹이 가능하도록 다양한 교류의 장이 충분히 마련되어 있었다. 매년 해당 분과를 찾는 연구자들이 새로운 참가자들을 자연스럽게 환영하는 분위기도 인상적이었으며, 이 분야의 발전을 이끌어 온 연구자들과 직접 소통하고자 하는 연구자들에게 특히 추천할 만한 학회라고 생각되었다.

1.2. 학회 전반에서 관찰된 핵심 연구의 흐름 

이번 학회에서 반복적으로 등장한 주제는 크게 네 가지였다.

첫째, Cas9 중심의 편집에서 벗어나 transposon, integrase, bridge recombinase 등 대형 삽입 및 재배열을 가능하게 하는 보다 다양한 도구를 자연계에서 발굴하려는 시도이다.

둘째, 개별 돌연변이 교정(mutation-specific/disease-specific)에서 벗어나, 보다 범용적인 치료 전략(mutation-agnostic)을 지향하려는 흐름이다.

셋째, CRISPR 기반 스크리닝과 머신러닝/AI의 결합을 통해 치료제 후보 발굴 및 최적화가 가속화되고 있다는 점이다.

넷째, LNP와 AAV, siRNA 전달체의 조직 선택성과 세포 표적화를 정밀하게 제어하려는 구체적인 연구가 활발히 이루어지고 있다는 점이다.

이러한 흐름은 유전체 편집이 기초과학의 상징적 도구를 넘어, 제조, 전달, 안전성, 임상 적용성까지 함께 고려해야 하는 보다 성숙한 단계로 이동하고 있음을 보여준다.

1.3. 학회 구성 및 공동 개최의 의의 

Precision Genome Engineering 분과와 Nucleic Acid Therapeutics and Targeted Delivery 분과의 공동 개최의 가장 큰 장점은 유전자 편집기 자체를 개선하는 연구와, 편집기 모듈을 실제 조직에 운반하는 전달체 연구가 같은 맥락에서 논의되었다는 점이다. 총 Joint Session은 2개였지만, Poster Session과 Career Roundtable과 같은 네트워킹을 위한 자리는 모두 Joint Session으로 준비되어 있어 ‘기초기전–도구개발–전달–치료’로 이어지는 하나의 파이프라인을 공유하는 연구자들이 한 자리에 모여서 네트워킹을 할 수 있었다는 점에서 큰 의의가 있었다.

2. 본론

2.1. Keynote Session

2.1.1. Jennifer A. Doudna, HHMI/University of California, Berkeley
- CRISPR Enzyme Evolution and Applications

학회의 유일한 Keynote Session은 CRISPR-Cas9을 통한 유전자 편집 기술 개발 공로로 2020년에 노벨 화학상을 수상한 Jennifer A. Doudna 교수님이 진행하였다. Doudna 교수님은 CRISPR가 “기초과학에서 출발해 실제 환자 치료로 이어진 대표적 사례”라는 점을 강조하며, 최근의 임상 치료 사례인 Victoria Gray의 사례 [1]와 Baby KJ [2]의 사례를 들며 발표를 시작하였다. 박테리아의 항바이러스 방어기작을 이해하려는 순수한 질문에서 출발한 연구 [3]가 Cas9의 RNA 유도 DNA 절단 기작 규명 [4]으로 이어졌고, 이후 단일 guide RNA 설계, 유전자 교정 플랫폼화 [5], 그리고 임상 적용 [1-2]까지 확장되었다는 흐름을 차례로 설명했다. 특히 Doudna 교수님 그룹에서 최초로 클로닝 한 Streptococcus pyogenes (stain=SF370)에서 유래한 SpCas9(연사는 “SpyCas9”으로 칭함)이 여전히 가장 널리 쓰이는 이유로 높은 활성, 우수한 동역학, 다양한 편집 포맷에 대한 범용성을 들었고, 겸상적혈구병에서의 FDA 승인 사례를 통해 유전체 편집이 이미 임상 현실이 되었다고 말했다. 하지만 동시에 치료의 대중적 접근성을 막는 가장 큰 병목으로 비용(cost)과 전달(delivery) 문제를 강조했다.

이번 발표에서는 특히 “전달” 문제를 해결하기 위한 부분에 초점을 맞추며, 전달에 용이한 소형 Cas9의 개발 문제를 TnpB 계열의 단백질을 통해 해결하기 위한 전략을 소개했다. TnpB 계열의 단백질은 Cas9의 조상 격의 단백질로 ~1,200개의 아미노산으로 이루어진 Cas9에 비해 훨씬 작은 ~400개의 아미노산으로 구성된 “작고 전달 친화적인 RNA-guided endonuclease”라고 소개되었다. 하지만 자연형의 TnpB는 대체로 genome editing 활성이 충분히 높지 않은 문제를 지니고 있다고 한다. 따라서 연구진은 구조 기반의 변이 도입 [6]과 단일분자 분석 [7]을 통해, 특정 세 군데의 점 돌연변이를 유도한 경우 TnpB가 DNA를 여는 과정에서 촉매 활성이 유지되는 상태(catalytically competent state)에 오래 머물게 함으로써 활성을 높인다는 점을 보여주었다.

Doudna 교수님은 TnpB에서의 이러한 최적화는 자연계에서 샘플링한 극히 제한된 단백질에 대한 국소적 최적화에 가깝기 때문에, 해당 메커니즘을 이해하는 단일분자 동역학에서 얻은 통찰을 일반화하여 더 넓은 서열 공간에서 TnpB 변이체를 예측하고 설계하는 전략이 필요하다고 주장하였다. 이를 위하여 연구진은 먼저 TnpB의 구조를 기반으로 같은 구조를 형성할 수 있는 다양한 서열 공간을 만든 후 그 안에서의 최적화 전략을 재현하기 위해 AI 기반(ESM-IF1)의 Inverse folding 전략 [8]을 도입하였다고 한다. 이때 RNA-guided nuclease에서는 구조만 보고는 기능에 꼭 필요한 접촉 잔기를 충분히 보존하기 어렵기 때문에, 진화적으로 보존된 자리를 일부 고정해야 기능을 잃지 않으면서도 나머지 서열 공간을 넓게 탐색할 수 있을 것이라고 주장하였다. 따라서 여러 strain에서 발견되는 자연계 TnpB의 서열을 MSA 분석을 통해 위치보존도(positional conservation)을 계산하고, TnpB 복합체의 서열 인식 부분 역할을 하는 reRNA와 TnpB의 활성을 개시하는 DNA 모티프인 TAM 부분 간의 공진화에 대한 변수를 계산하여, 이 변수들이 높은 부분을 “기능적으로 중요한 residue”라 정의하여 masking 한 후 이 부분이 아닌 지역에서 inverse folding을 통해 발생한 새로운 변이들을 screening의 대상으로 사용했다고 한다. 이를 통해 이전의 삼중 점돌연변이처럼 소수 hotspot만 국소적으로 고친 것이 아니라, 더 넓은 서열 공간에서 기능을 유지하거나 향상시키는 비자연적 variant를 찾아낼 수 있었다고 한다.

이 발표가 중요했던 이유는 단순히 새로운 효소 후보를 소개한 것이 아니라, 앞으로의 편집 도구 개발이 ‘자연계에서 하나를 찾아오는 방식’에 ‘인공지능 기반의 대규모 데이터와 계산을 이용해 기능 공간을 탐색하여 최적화’하는 방식을 추가하는 방향으로 가속화시킬 수 있다는 새로운 방향성을 제시했기 때문이다.

그림 1. Jennifer A. Doudna 교수의 Keynote 발표

2.2. Session - Delivery (Joint)

2.2.1. Daniel J. Siegwart, University of Texas Southwestern Medical Center
- Development of Signal Peptide Engineered Nucleic Acid Design (SEND) mRNAs and Ionizable Phospholipid (iPhos) Lipid Nanoparticles (LNPs) that Control Localization of Protein Therapeutics

Daniel J. Siegwart 교수님은 mRNA therapeutics의 확장 가능성을 “몸 자체를 바이오팩토리로 활용하는 전략”이라는 관점에서 제시하였다. 연사는 mRNA가 속도, 모듈성, 그리고 범용성을 갖는 약물 모달리티임을 강조하며 발표를 시작했다. 즉, mRNA는 단순한 백신 플랫폼에 그치지 않고, 유전자 편집기, 효소, 호르몬, 백신 등 매우 다양한 단백질을 암호화할 수 있기 때문에, 향후 치료제 개발에서 범용성이 큰 플랫폼이 될 수 있다는 것이다. 또한 미국 FDA가 승인하는 신규 약물의 약 3분의 1이 단백질 기반 또는 핵산 기반이라는 점을 언급하며 핵산 기반 약물이 주요한 약물 계열로 자리 잡고 있음을 강조하였다.

이 발표의 핵심 메시지는, mRNA를 이용하면 외부에서 완성된 단백질 약물을 반복 투여하는 대신 환자의 몸 안에서 원하는 치료 단백질을 직접 생산하도록 만들 수 있다는 점이었다. 즉, 특정 조직이나 세포가 치료 단백질을 생산·분비하는 bio-factory가 되도록 한다는 점이다. 이를 위해서는 핵산을 안정적으로 보호하고 원하는 조직에 전달하며, 세포 내에서는 엔도좀 탈출까지 효율적으로 유도할 수 있는 전달체가 필요하다고 설명하였다. 연사는 이러한 문제를 해결하기 위한 전략으로, 엔도좀 환경에서 중성에 가까운 상태를 형성해 막 융합과 탈출을 촉진하도록 설계된 ionizable phospholipid (iPhos) 기반 LNP를 제시하였다 [9].

발표의 후반부에서는 signal peptide engineering을 결합하여, 세포 안에서 만들어진 단백질을 원하는 위치로 보내거나 세포 밖으로 분비시키는 전략을 소개하였다. 특히 signal peptide를 유전자 간에 모듈처럼 붙여 활용할 수 있고, 이를 통해 단백질의 분비 양상과 약동학을 조절할 수 있다는 점을 주장하였다 [10]. 실제로 anti-PD-L1 항체와 같은 치료 단백질을 mRNA로 전달해 간이 이를 수일간 지속적으로 생산·분비하도록 한 사례를 제시하며, 완성된 단백질을 직접 투여하는 방식과는 다른 PK(pharmacokinetics) 패턴을 유도할 수 있음을 보여주었다. 이 발표는 mRNA 치료제를 단순한 유전정보 전달 수단이 아니라, 체내 특정 조직을 치료 단백질 생산 공장으로 전환하는 플랫폼으로 확장했다는 점에서 의미가 크다고 생각되었다.

2.2.2. Anastasia Khvorova, RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School
- Barcoded Libraries for Targeted siRNA Delivery

Khvorova 교수님은 siRNA 전달에서 조직 분포와 세포 특이성을 제어하기 위한 화학적·생물리학적 전략에 대해 발표하였으며, 생물리학적 특성(biophysical property)과 크기(size)를 활용한 전달 전략의 특징 [11], 그리고 in vivo barcode screening 기법을 이용해 화학적 building block의 조합으로 새로운 표적화 기술을 탐색하는 접근을 소개하였다.

siRNA 전달에서 흥미로운 점은 약물이 세포 안에 도착하더라도 상당 부분이 엔도좀과 리소좀 안에 갇힌다는 점이다. 이때 화학적으로 변형된 siRNA는 세포 내에서 안정적으로 유지될 수 있기 때문에, 이러한 포획 상태가 일종의 저장소처럼 작용하여 약물이 오랜 시간에 걸쳐 천천히 방출될 수 있다고 설명하였다. 이는 RISC complex에 siRNA를 지속적으로 공급하여 장기간 효과가 유지되는 데 기여할 수 있다는 것이다. 연사는 그 예시로 근육 성장 억제 단백질인 Myostatin을 표적하는 siRNA에 XMA와 같은 추가적인 화학적 안정화 [12]를 도입한 경우, 단 한 번의 주사만으로도 마우스에서 약 2개월 동안 효과가 지속될 수 있음을 제시하였다. 또한 이러한 축적 양상은 조직마다 다르게 나타났는데, 골격근에서는 8배의 용량 증가가 거의 100배에 가까운 근육 내 축적으로 이어진 반면, 심근에서는 보다 선형적인 관계를 보였다고 설명하였다 [13].

후반부에서는 화학적 전달체 설계를 통해 표적화하는 기술에 대해 소개하였는데, 개별 화학물질을 각각 스크리닝 하는 기술의 한계를 극복하기 위해 디자인 한 in vivo barcode screening 기반의 대규모 화학 라이브러리 탐색 전략을 소개하였다. 다양한 화학적 building block을 붙인 oligonucleotide library를 barcode와 함께 제작하고, 이를 동물에 직접 투여한 뒤 조직별 enrichment를 sequencing으로 읽어냄으로써, 어떤 화학 구조가 간, 신장, 폐, 특정 세포형으로 잘 전달되는지를 체계적으로 매핑할 수 있다는 것이다. 특히 간 표적 GalNAc, 전신 분포형 DCA뿐 아니라, 간 내 endothelial cell 또는 신장 podocyte에 상대적으로 특이적인 신규 delivery entity를 찾은 사례는 인상적이었다.

2.2.3. Leah R Sabin, Regeneron Pharmaceuticals 
- A Modular, Antibody-Based AAV Retargeting Approach For In Vivo Gene Delivery to the CNS

Regeneron의 Sabin 박사는 전신 투여되는 AAV 기반 유전자치료에서 가장 큰 병목 중 하나인 간 외 조직으로의 효율적인 전달 문제를 해결하기 위한 전략으로, 항체를 이용한 AAV retargeting 플랫폼을 소개하였다. 현재 LNP, GalNAc, AAV와 같은 1세대 전달 기술은 간을 표적하는 데에는 상당히 최적화되어 있지만, 간 이외의 조직을 표적하기 위해서는 여전히 높은 용량 투여에 의존하는 경우가 많고, 그 결과 임상에서는 간독성과 같은 안전성 문제가 반복적으로 관찰된다고 설명하였다. 이에 따라 연사는 AAV 캡시드 자체의 간 표적성은 낮추고, 대신 항체를 이용해 표적 조직 전달은 높이면서 비표적 장기 독성은 낮추는 전략을 제시하였다. 이를 위해 Regeneron은 항체를 바이러스 캡시드 표면에 직접 결합시키는 방식과, 한쪽은 캡시드에 다른 한쪽은 표적 세포에 결합하는 bispecific antibody 방식의 두 가지 모듈형 플랫폼을 개발하였다고 한다.

2.3. Session - New Editing Modality

2.3.1. Samuel H Sternberg, Columbia University
- Mining reverse transcriptase (RT)-based immune systems

Sternberg 교수님은 Jennifer Doudna 교수님 연구실에서 박사학위를 수여한 연구자로 앞서 Doudna 교수님 (2.1.1)의 발표의 TnpB에 이어서 다양한 유전체 공학 기계들의 진화를 탐구해 왔다고 하며 발표를 시작하였다. 연사는 현재 박테리아 세계에서 유전물질이 끊임없이 재편되는 현상에 주목하고 있다고 하였는데, 이 중심에는 전이인자(transposon)가 있으며 이러한 요소들이 단순한 이동성 유전요소를 넘어 숙주가 재활용할 수 있는 기능적 저장고로 작용해 왔다고 설명하였다. 연사는 이를 설명하기 위해 “exaptation”(기존 구조의 기능 전용)이라는 개념을 제시하며, 본래는 자기 복제를 위해 존재하던 분자 기계들이 진화 과정에서 숙주의 새로운 기능으로 전용되어 왔다고 설명하였다. 해당 연구 그룹에서 기존의 관심을 가지고 있던 “RNA-guided transposase [14]”도 CRISPR-Cas 시스템에서 exaptation 된 형태의 시스템이라고 설명하였다.

발표는 연구진이 최근 발견한 defense-associated reverse transcriptase (DRT) 계열 항바이러스 면역 시스템에 집중하였는데, DRT10 계열이 보여주는 독특한 reverse transcription 메커니즘 [15]과 이 계열의 메커니즘의 진핵생물의 telomerase와 진화적으로 연결될 수 있다는 가능성에 대한 주장 [16]이 중심을 이뤘다. 연구진은 DRT10 시스템이 non-coding RNA를 주형으로 하여 짧은 9염기 서열이 반복적으로 이어진 concatemeric DNA가 생성한다는 점을 실험적으로 보였고, 이러한 과정이 단순한 역전사가 아니라 특정한 RNA 구조와 microhomology에 의해 정교하게 프로그램되어 있다는 점을 강조하였다. 특히 DRT10의 주형 역할을 하는 non-coding RNA를 발굴하는 과정에서 기존의 mapping 프로그램으로는 찾기 어려웠던 반복 motif를 새로운 알고리즘을 통해 발견하고, 이를 생화학적으로 검증한 과정은 설득력 있었다. 특히나 생화학적 검증 과정에서는 단백질 밴드가 shift 되어 있는 경향을 데이터를 바탕으로 DRT10의 산물인 DNA가 RT 단백질 자체에 공유결합되어 있을 것으로 가설을 세우고 이를 alpha-fold를 이용하여 뒷받침하여 이 부분이 serine 기반의 공유결합이라는 것을 입증하는 과정에서 쉽게 놓칠 수 있었던 데이터를 통해 DRT10의 구조에 대한 단서까지 찾아냈다는 점이 상당히 인상 깊었다.

이후에 연사는 DRT의 진화적 계보 분석을 통해 진핵생물에서의 클레이드가 telomerase라는점을 들어 진화적으로 연결될 수 있다는 제안을 하였다. 연사의 말을 요약하자면, RNA를 주형으로 DNA repeat를 추가하는 DRT 계열의 효소들이 진행생물에서는 선형 염색체의 말단 문제를 해결하는 진화적 적응에 “exaptation”되었다. 이번 발표는 새로운 방어 시스템 하나를 소개하는 데 그치지 않고, 생명체가 지닌 기존 분자 기계들이 진화의 과정에서 어떻게 전용되어 왔는지에 대한 예시를 보여주어 통찰이 있던 발표라고 사료되었다.

2.3.2. Cecilia Cotta-Ramusino, Tessera Therapeutics
- Discovery and Application of New Gene Editing Modalities to Treat Disease

Cotta-Ramusino 박사는 Tessera 사가 RNA gene writer를 개발하기 위해서 레트로트랜스포존(retrotransposon)을 어떻게 활용하고 있는지 설명하였다. 레트로트랜스포존은 RNA intermediate를 통해서 donor strand에서 recipient strand로 유전정보를 이동시키는 이동성 유전요소의 부류이다. Tessara 사는 이중 LINE-1으로 대표되는 non-LTR 레트로트랜스포존에 집중하였다고 한다. 특히 자연계에 존재하는 다양한 레트로트랜스포존 서열을 계산적으로 발굴하고 재구성한 뒤, 이들이 인간 세포에서 원하는 RNA를 인식하여 삽입할 수 있는지 평가함으로써 새로운 유전자 삽입 도구로 개발하고자 하였다. 연사는 이러한 접근을 통해 일부 요소들이 실제로 포유류 세포와 일차 T 세포에서 작동하며, 특정 유전자에 치우치지 않는 비교적 무작위적인 삽입 양상을 보인다고 설명하였다. (이 “무작위성”에 대해서는 몇몇의 연구자들이 적극적으로 질문을 하긴 하였다.)

또한 Tessera 사는 이러한 RNA gene writer를 단순한 세포 내 실험 수준에 머무르게 하지 않고, LNP 전달 기술과 결합하여 in vivo 유전자 편집으로 확장하는 과정을 진행하고 있다고 한다. 발표에서는 CAR를 삽입하는 전략을 예로 들어, RNA gene writer를 이용한 T 세포 엔지니어링이 종양 제거와 B 세포 제거 같은 기능적 효과로 이어질 수 있음을 보여주었다. 특히 기존 lentivirus 기반 방식과 비교했을 때 무작위적 삽입 양상, RNA 기반 전달, multiplexing 가능성 등을 장점으로 제시하였다. 아직 데이터는 대동물 수준에서는 일부 결과만 제시되었지만, 이동성 유전요소를 새로운 치료용 유전자 삽입 플랫폼으로 활용하고자 하는 시도가 앞으로 어떻게 진행될지 기대할 수 있게 한 발표였다.

2.3.3. Erik J Sontheimer, Erik J Sontheimer, University of Massachusetts Medical School
- Prime Assembly with Linear DNA Donors Enables Large Genomic Insertions

Sontheimer 교수님은 선형 DNA donor를 이용해 큰 유전체 삽입을 가능하게 하는 prime assembly 기술을 소개하였다 [17]. 연사는 기존의 prime editing이 짧은 서열 교정에 주로 활용되어 왔다면, 이번 접근은 보다 큰 삽입을 mutation-agnostic(본 학회에서 자주 등장하는 핵심 용어 중 하나인데, 특정 mutation에 국한하지 않는 치료 접근법을 의미한다.)한 방식으로 구현하려는 시도라고 설명하였다. 이를 위해 twin prime editing과 유사한 paired prime editing 형식을 사용하되, 서로 겹치지 않는 두 flap 서열을 먼저 유전체에 설치하고, 양 끝에 이와 상보적인 서열을 가진 선형 DNA donor를 포획하여 삽입하는 전략을 제시하였다. 특히 원형 plasmid donor는 작동하지 않고 선형 donor에서만 효율적인 삽입이 가능하다는 점, 그리고 reverse transcriptase 활성이 반드시 필요하다는 결과를 통해 이 방법이 기존 HDR 기반 삽입과는 다른 원리로 작동함을 보여주었다.

신기한 부분은 이 시스템이 생각보다 높은 효율과 정확도로 작동한다는 점이었다. 발표에서는 여러 PCR 기법과 sequencing 기술을 이용해 올바른 크기의 삽입이 높은 비율로 일어나며, 전반적인 junction fidelity도 우수하다고 주장하였다. 또한 NHEJ 억제제인 AZD7648 처리 시 효율이 증가하고 정확도가 향상된다는 결과를 바탕으로, prime assembly 과정에서 경쟁적으로 작용하는 DNA 복구 경로가 존재할 가능성도 함께 시사하였다. 더 나아가 donor를 둘, 셋, 혹은 그 이상으로 나누어 세포 내에서 조립되도록 만드는 방식까지 제시하면서, 이 기술이 단순한 삽입을 넘어 여러 조각의 DNA를 세포 내에서 연결하는 방향으로 확장될 수 있음을 보여준 점도 흥미로웠다.

이어서 연사는 해당 기술의 치료적인 가능성을 피력했는데, 가장 큰 유전자라고 불리는 dystrophin cDNA까지 삽입할 수 있음을 보여주었고, 여러 유전체 위치와 여러 세포주, 더 나아가 primary human fibroblast에서도 편집이 가능함을 제시하였다. 특히 cell cycle arrest 조건에서도 효율이 크게 감소하지 않고, RAD51 inhibitor나 nocodazole 처리 결과를 함께 고려했을 때 HDR-independent mechanism일 가능성을 제시한 부분은, 이 기술이 기존의 상동성 재조합 기반 삽입과는 다른 장점을 가질 수 있음을 시사하였다. 또한 double-stranded donor뿐 아니라 single-stranded donor도 활용 가능하다는 점은, 향후 독성이나 전달 문제를 줄이는 방향으로의 추가 개발 가능성을 보여준다고 생각되었다.

비교적 질의응답 부분에서 기술적인 지적이 구체적으로 논의되었다. 예를 들어 불완전 삽입이나 indel이 어느 정도 발생하는지, 그리고 partial insertion으로 보이는 밴드가 실제 산물인지 PCR artifact인지 등 기술적인 질문이 많았다. 또한 이 방법이 정말 HDR-independent 한 지에 대한 메커니즘에 대한 검증, 그리고 다른 대형 삽입 기술들과의 비교 가능성도 제기되었다. 이에 대해 연사는 아직 완전히 규명되지 않은 부분이 많음을 인정하면서도, 지금까지의 데이터는 비교적 높은 정확도와 낮은 off-target 삽입, 그리고 다른 플랫폼 대비 경쟁력 있는 효율을 보여준다고 설명하였다.

2.3.4. Shannon M Miller, Scripps Research
- Programmable CRISPR-free gene insertion

Miler 교수님은 해당 그룹에서 새로 개발하는 MGRE라는 single-stranded annealing protein (SSAP) 기반의 CRISPR 비의존적 gene insertion 기술에 대해 발표하였다 연사는 기존 CRISPR 기반 치료 전략이 개별 돌연변이에 따라 서로 다른 설계가 필요해질 수 있고, 이러한 점이 특히 in vivo 적용에서 한계가 될 수 있다고 설명하였다. 이를 극복하기 위해서는 mutation-agnostic 치료가 필요하다고 주장하였는데, 이는 특정 돌연변이 자체를 교정하는 데 초점을 두기보다 해당 유전자의 기능 회복을 목표로 하는 접근이다. 따라서 질환마다 매우 다양한 병원성 변이가 존재하더라도, 정상 coding sequence를 적절한 위치에 삽입할 수 있다면 보다 넓은 환자군에 공통적으로 적용 가능한 치료 전략이 될 수 있다고 주장하였다.

연사는 박테리아의 recombineering 개념을 인간 세포에 확장하여, RecT 계열 단백질을 이용한 상동성 기반 삽입을 구현하려 했다. 이 기술은 donor DNA 양끝에 표적 유전체 서열과 상보적인 상동서열을 부여하고, RecT 계열 단백질이 이를 복제 중 노출된 DNA와 결합하도록 도와 삽입을 유도하는 방식이라고 설명하였다. 즉, 특정 표적 서열을 직접 절단하거나 재조합하는 방식이라기보다, 상동서열을 가진 donor가 표적 위치에 안정적으로 자리 잡도록 유도한 뒤 세포의 복제 및 수선 과정을 통해 삽입이 고정되는 개념으로 이해되었다. 개념적으로만 본다면 전통적은 gene insertion 기술과 달리 random insertion이 아니라는 점에서 흥미로웠지만, off-target 문제, 부분적인 insertion 문제 등 정확도에 대한 엄밀한 검증이 추가적으로 필요할 것으로 보였다.

2.3.5. Liam J Bartie, Arc Institute / University of California, Berkeley
- Programmable Genome Rearrangement at Megabase Scale with Bridge Recombinases

UC Berkeley의 Patrick Hsu 연구실의 박사과정 학생 Bartie의 발표는 대규모 유전체 재배열을 위해 개발한 transposon 기반의 recombination 기술에 대해 설명하였다 기존의 재조합 기반 기술은 큰 DNA를 다룰 수는 있지만 표적화 가능성이 제한적이거나, 반대로 높은 특이성을 가지더라도 자유롭게 재프로그래밍하기 어렵다는 한계가 있었다. 이에 비해 연사는 IS110 계열 transposon에서 유래한 bridge recombinase가 두 DNA를 동시에 인식하는 non-coding RNA를 이용해 삽입, 절제, 역위, 전좌와 같은 다양한 재배열을 유도할 수 있다고 설명하였다. 특히 하나의 메커니즘으로 여러 종류의 대규모 구조 변이를 다룰 수 있다는 점에서, 기존의 CRISPR 기술만으로는 해결하기 어려웠던 발암과정의 거대한 구조 변이나 Huntington 병 등에서 발견되는 반복성 변이들에 대한 치료를 상상할 상상할 수 있게 한다는 점에서 인상적이었다.

연사는 인간 세포에서 실제로 작동 가능한 ortholog를 선별하고 구조 예측과 변이 스크리닝을 통해 효율과 특이성을 개선해 나갔다. 이러한 과정은 Feng Zhang 교수님의 제자였던 Patrick Hsu 교수가 지난 10년간 쌓아온 테크닉의 집대성으로 보였다. 스크리닝 및 최적화 결과 약 1 Mb에 이르는 큰 genomic DNA 구간의 이동이 가능하다는 결과를 보여주었고, 이 기술이 기존의 소규모 정밀 편집을 넘어 염색체 수준의 구조 재배열까지 다룰 수 있는 잠재력을 보여주었다. 더불어 Friedreich 운동실조증의 GAA repeat 절제 가능성을 예시로 제시한 점은, 이러한 도구가 질환 모델링뿐 아니라 반복서열 확장 질환의 치료 전략으로도 확장될 수 있음을 시사하였다. 아직 특이성, off-target 재배열, guide 길이 한계 등 해결해야 할 과제는 남아 있어 보였지만, 구조 변이를 직접적으로 다루는 새로운 유전체 공학 도구로서 매우 흥미로운 발표였다.

2.4. Session - Intersection of Gene Editing High Throughput Screening and Machine Learning

2.4.1. Hyongbum Henry Kim, Yonsei University College of Medicine
- Experimental and Machine Learning Approaches to Create New Genome Editing Tools

김형범 교수님은 Prime Editing 기술을 이용한 대규모 기능 스크리닝을 이용해 암 및 유전질환 관련 변이의 기능을 체계적으로 평가하는 전략을 소개했다. 연사는 전립선암에서 androgen receptor(AR) 변이가 약물 반응과 내성에 큰 영향을 주지만, 임상적으로 어떤 변이가 실제 내성을 유발하는지에 대한 기능 정보가 부족하다는 점을 설명했다. 이어서 이러한 한계를 극복하기 위해, prime editing과 시퀀싱을 결합한 high-throughput 변이 프로파일링(PEER-Seq [18])을 이용해 변이의 기능상실 여부, 약물 내성 여부, 그리고 임상적 연관성을 평가하는 접근을 제시했다.

PEER-Seq은 Prime-editor(PE) 발현 세포주에 렌티바이러스 라이브러리를 도입하여 세포마다 서로 다른 단일 변이를 갖도록 유도한다. 그리고 이를 약물 처리군과 비처리군으로 나눈 후 생존한 세포에서의 라이브러리를 NGS로 비교함으로써 어떤 변이가 내성을 유발하는지 확인하는 전략이다. 이 기술에 대한 검증을 ATM 유전자를 예시로 들어 ~23,000개의 단일 변이를 기능적으로 평가한 결과[19]를 소개했다. PARP inhibitor 선택압을 이용해 ATM 기능이 손실된 세포와 유지된 세포를 구분함으로써 각 변이를 기능성 또는 비기능성으로 분류했고, 이후 이 결과를 UK Biobank 데이터와 연결해 비기능성 ATM 변이를 가진 사람들에서 암 발생 위험이 실제로 더 높음을 보였다. 또한 실험적으로 직접 평가하기 어려운 영역의 변이를 예측하기 위해, 단일 변이의 표현형을 예측할 수 있는 딥러닝 모델 DeepATM을 개발했으며, 이를 통해 추가적인 ATM 변이의 기능과 암 위험성을 예측할 수 있음을 제시했다.

이후 이 기술을 AR 변이에 적용하여 두 가지 약물 내성 변이를 규명한 결과를 제시했다 [18]. 특히 한 종류의 약물에 대해서는 ~200개의 내성 변이가 발견되었고, 이중 다수는 기존에 의미불명 변이로 분류되는 변이였다. 이때 AR 변이를 정밀하게 프로파일링 하기 위해서는 PE 자체의 정확도와 효율을 높이는 것이 중요했다고 하며, 연사는 이를 위해 몇 가지 기술적 개선을 소개했다. 먼저 프로파일링 과정에서 편집 효율이 0%에 가까웠던 경우가 발견되었는데, 이들에서 RTT에 poly-T 서열이 발견되었다고 하며, 이를 synonymous mutation을 추가해 해당 문제를 회피함으로써 편집 효율을 크게 높였다고 한다. 또한 기존 PEmax 대신 개선된 형태의 PEmax를 이용해서 편집 효율을 향상시켰고, 그 결과 거의 모든 변이를 높은 정확도로 분석할 수 있게 되었다고 한다. 이를 통해 AR 변이의 기능상실 여부를 종합적으로 분류하여 androgen insensitivity syndrome과 관련된 변이 해석에도 적용할 수 있음을 설명했으며, nonsense, synonymous, missense 변이들이 각각 예상되는 방향으로 기능성을 보인다는 점도 제시했다.

해당 발표는 유전체 편집 도구를 활용하여 질병에 유의미한 변이를 규명했다는 점에서 혁신적인 측면이 있으면서도, Deep Learning 모델을 개발하는 데에 있어서 좋은 데이터셋을 디자인하고 구축하는 것의 중요성을 강조한다는 측면에서 매우 의미 있는 발표였다.

2.4.2. Jonathan S. Weissman, Whitehead Institute, HHMI, and MIT
- Learning our Fate from a Data-driven Virtual Map of Mammalian Development

Ribosome profiling (Ribo-Seq [20])과 Perturb-seq [21] 등 생물학적 현상을 고해상도로 읽어내는 혁신적인 플랫폼 기술을 개발하며, 현대 분자생물학의 패러다임을 선도해 온 Weissman 교수님께서는 이번에는 PEtracer [22]라는 플랫폼 개발을 통해 발생생물학의 새로운 패러다임을 제시하였다. PEtracer는 prime editing을 이용해 세포 계통 정보를 DNA에 점진적으로 기록하고, 이를 scRNA-seq(단일세포 시퀀싱)과 MERFISH 같은 공간 전사체 기술로 함께 읽어낼 수 있도록 설계된 lineage tracing 기법이다. 즉, 세포가 현재 어떤 상태에 있는지 뿐만 아니라 그 세포가 어떤 분열과 분화를 거쳐 왔는지를 공간 정보와 함께 동시에 복원하려는 시도라는 점에서, 기존의 계통 추적 기술을 확장한 접근이라 할 수 있다.

강연의 출발점은 발생생물학이 오랫동안 품어온 가장 근본적인 질문이었다. 연사는 20세기 생물학의 대표적 성취 중 하나는 예쁜꼬마선충을 이루는 약 1,000개의 세포를 어떻게 만들어내는지를 완전한 운명 지도(fate map)로 정리한 일이라고 하였다. 이러한 세포 운명 지도는 발생 과정에서 세포 상태, 계통, 공간적 위치가 어떻게 맞물리는지를 이해하는 토대가 되었지만, 이 지도는 포유류에서는 아직 단 한 번도 완성된 바 없다고 한다. 이는 복잡한 구조를 지닌 생명체의 발생일수록 1) 규모가 매우 크고(세포가 매우 많고), 2) 결정론적이지 않으며(확률적인 요소가 있으며), 3) 자기 교정 능력이 있는 경우가 있고, 4) 발생 자체가 관측하기 어려운 자궁 내에서 일어나기 때문이라고 한다.

이 한계를 넘기 위해 최근에는 DNA 자체를 기록 매체로 사용하는 전략을 사용하였다. 즉, 세포 계통을 일종의 분자적 기록으로서 DNA에 남기겠다는 뜻이다. 초기의 분자적 lineage tracing에서는 세포 내 특정 DNA 영역, 즉 비교적 중립적인 역할을 하도록 설계된 기록용 표적 부위(“scratch pad”)에 CRISPR-Cas9이 작동하게 하여 돌연변이를 확률적으로 축적시키는 방법이 채택되었다고 한다 [23]. 그러나 이러한 Cas9 기반 molecular recording에는 뚜렷한 한계가 존재했다 [22]. 첫째, Cas9이 만들어내는 indel은 무작위성이 크기 때문에 미리 정의된 probe로 구별하기 어렵고, 따라서 조직 내 공간 정보를 보존한 채 in situ imaging으로 직접 읽어내기 힘들었다. 둘째, double-strand break 자체가 생물학적으로 중립적이지 않다는 문제도 있었다. p53 반응과 DNA damage response를 유발할 수 있는 절단을 세포분열에 맞추어 반복적으로 축적시키면, 원래 추적하고자 하던 발생 과정 그 자체를 교란할 가능성이 있기 때문이다.

Weissman 교수님 연구진은 이러한 한계를 뛰어넘기 위해 prime editing, MERFISH, 그리고 AI 기반 reconstruction을 제시하였다. Prime editing은 미리 정해진 barcode를 정확하게 삽입할 수 있게 해 주었고, MERFISH는 이 predefined barcode와 세포 상태를 정의하는 전사체를 같은 조직 절편에서 함께 읽어낼 수 있게 해주었으며, AI는 여러 시점의 snapshot들을 연속적인 발생 영화로 연결하는 계산적 틀을 제공하였다.

그 결과 개발한 플랫폼인 PEtracer는 PEtracer는 DNA 안에 편집 가능하고 RNA로 전사가 가능한 scratch pad를 디자인하여 삽입하고, 각 scratch pad에 대해 prime editor가 8가지 predefined lineage mark 중 하나를 삽입하도록 설계되었다. 연사는 배아 모델에서 36개의 서로 다른 유전체 위치에 걸쳐 100개가 넘는 editable site를 확보했다고 설명했으며, 각 site가 8가지 상태를 가질 수 있다는 점에서 이론적 조합 수는 실질적으로 세포분열 이력을 모두 감당하기에 충분하다고 강조하였다 (이를 “우주의 원자 수보다도 많다”라고 표현하였다.). 또한 pegRNA와 edit site 사이의 protospacer mismatch를 조정함으로써 editing kinetics를 빠르게는 1주 이내, 느리게는 수주에서 수개월 단위까지 조절할 수 있어, 서로 다른 생물학적 timescale에 맞춘 recording이 가능하다는 점도 인상적이었다. 실제로 이 플랫폼을 통해 E9.5 배아 하나에서 ~33만 개의 세포를 확보하고, 이를 정교하게 annotation 함으로써, lineage와 cell state를 함께 다루는 고해상도 지도가 제시되었다.

이어서 연사는 모든 세포에 barcode가 기록된다 하더라도 그것만으로는 완전한 “발생의 영화”가 바로 복원되는 것은 아니라고 설명하였다. 특정 시점에서 얻어진 세포들의 lineage tree와 최종 cell state는 알 수 있지만, 그 계통수의 내부 노드, 즉 중간 조상세포가 어떤 전사 상태를 가졌는지는 직접 관측되지 않기 때문이다. 이를 극복하기 위해 연구진은 진화생물학의 ancestral reconstruction 문제의 해결 방식에서 영감을 받아 diffusion 모델 기반의 conditional generator를 구축하여 더 이른 시점의 실제 세포 분포를 조건으로 사용하여 미래 방향과 과거 방향을 오가며 일관된 조상 상태를 추정할 수 있도록 하였다. 이를 연사는 autoencoder와 decoder가 같은 이미지를 재구성하도록 하는 “cycle-consistency objective”개념과 같다고 설명하였다. 이를 통해 각 세포 분열 시점마다 어떤 결정이 일어나고 있는지, 서로 다른 시간점 사이를 따라가며 볼 수 있다고 주장하며, PEtracer가 생산하는 데이터는 virtual model 학습을 위한 훌륭한 데이터셋이라는 점을 강조하였다.

Weissman 교수님의 발표는 단지 하나의 새로운 기법을 소개하는 자리라기보다는, 현대 생물학에 매우 중요한 순간을 함께하고 있는 느낌을 들게 해 줄 정도로 인상 깊었다. 현재 Weissman 교수님이 소개한 단계까지는 단순히 fate mapping 문제에 머물러 있지만, 이 기술이 상용화가 될 수 있다면 “embryonic lethal”으로 제대로 설명할 수 없었던 생물학전 문제나, 약물에 의한 기형의 발생, 엽산 등이 신경관 결손을 어떻게 줄일 수 있는지 등의 문제에 답을 찾을 수 있도록 하는 혁신으로 사료되었다. 또한 단순히 인공지능 기반의 Virtual cell project와 비교되게, 생물학적으로 매우 복잡한 사건을 기록할 수 있는 기술 기반의 훌륭한 데이터셋을 구축하여 이를 기반으로 모델을 확립하는 것이 AI 시대에 생물학 전공자만이 할 수 있는 최고의 역량이라고 생각되어, 다시 한번 인상 깊은 강연이었다.

2.4.3. Randall J. Platt, ETH Zurich
- Transcriptome-wide Recording in Human Cells

Platt 교수님은 Weissman 교수님의 강연에 이어서 또 다른 전략의 molecular recording 개념을 소개하였다. 연사는 이전의 기술과 달리 세포에서 일어난 전사(transcription)의 이력 자체를 세포 안에 저장하도록 RNA-binding domain과 biomolecular condensate 형성 도메인을 결합한 합성 소기관 “recordingelle”을 미토콘드리아 표면에 구축하여, 세포 내 RNA를 시간에 따라 포획한 후 보존하여 이후 qPCR이나 RNA-seq으로 읽어내는 개념을 제시하였다 [24].

Phage coat protein 기반 시스템을 이용해 특정 engineered RNA를 선택적으로 recordingelle로 모집할 수 있음을 proof-of-principle로 보였고, 이어 poly-A tail을 인식하는 RNA-binding protein을 적용하여 이 개념을 전사체 전체 수준으로 확장하였다. 특히 여러 후보 중 PABPC4 기반 설계가 가장 유망하였으며, 최적화된 변이체를 사용했을 때 세포질 mRNA의 대부분을 미토콘드리아 결합 recordingelle 분획으로 끌어올 수 있음을 제시하였다. 또한 이러한 RNA 포획이 whole-cell 수준의 유전자 발현을 거의 교란하지 않아, 세포가 비교적 안정적으로 이 시스템을 수용할 수 있다는 점도 함께 보여주었다.

이 시스템은 기존의 molecular recorder인 “언제 정확히 유전자 발현이 시작되었는가?”와 달리 “이 세포는 어떤 발현을 누적해서 겪었는가?”를 파악하기 위한 시스템으로서의 강점을 지녔다. 연사는 예시로 HEK 세포에 interferon-를 일시적으로 처리한 뒤, 일반적인 조건에서는 시간이 지나며 interferon response gene의 발현이 다시 baseline으로 돌아가지만, recordingelle이 존재하는 경우 해당 RNA 정보가 이후 시점에도 유지된다는 결과를 제시하였다. 초기 버전에서는 포획된 RNA가 translation에 계속 사용되며 신호가 증폭되는 문제가 있었으나, PABPC4와 EIF4G의 상호작용을 차단하는 변이를 도입해 이를 개선함으로써, RNA는 유지하되 비의도적 신호 증폭은 줄인 version 2 시스템을 확립하였다.

또한 이 기술은 최소 수일 동안 기록을 유지할 수 있고, 적은 수의 세포에서도 신호를 검출할 가능성을 보였으며, interferon-β 자극 후 Wnt 자극을 순차적으로 가했을 때 두 사건의 흔적을 모두 보존할 수 있다는 점에서 연속적인 세포 상태 변화의 기록에도 응용 가능함을 시사하였다. 전반적으로 이번 발표는 세포가 과거에 어떤 자극과 상태 변화를 겪었는지를 전사체 수준에서 읽어내기 위한 새로운 synthetic biology 도구를 제안한 것으로, 향후 분화, 발생, 병인, 약물 저항성 등 다양한 생물학적 과정의 시간적 해석에 유용한 플랫폼이 될 수 있음을 보여주었다.

2.4.4. Shengdar Q Tsai, St. Jude Children's Research Hospital
- High-throughput Biochemical and Cellular Approaches towards Developing a CRISPR Therapeutic Genome Editing Platform

Tasi 교수님은 유전체 편집 치료를 실제 환자 맞춤형 정밀의료로 발전시키기 위해서는, 단순히 편집기를 개발하는 것을 넘어 표적 활성(on-target activity; 원하는 표적의 편집)과 비표적 위험(off-target risk; 원하지 않는 유사 표적의 편집)을 정밀하게 평가하고 예측할 수 있는 플랫폼이 필요하다는 점을 강조했다. 연사는 그동안 개발해 온 GUIDE-seq, CHANGE-seq와 같은 전장 유전체 수준의 분석법을 바탕으로, 유전자 편집기의 on/off-target 활성을 보다 민감하게 측정하기 위한 전략을 소개하였다 [25]. 또한 기존에는 연구된 target과 off-target 데이터 수가 제한적이고, 인간 유전체 자체의 제약 때문에 mismatch 조합이 고르게 확보되지 않아 예측 모델의 학습에도 한계가 있었다고 지적하였다. 이를 극복하기 위해 환자 돌연변이 라이브러리, pooled GUIDE-seq, 개인 간 유전변이의 영향 분석 등으로 더 크고 다양한 데이터를 축적하고, 나아가 고처리량 분석법으로 수백만 개의 mismatch target 활성을 측정해 딥러닝 모델 학습에 활용하고 있다는 점이 매우 흥미로웠다.

또한 발표 후 질의응답에서는 ABE8E와 같은 base editor가 Cas9보다 더 높은 off-target 활성을 보일 수 있다는 점이 논의되었는데, 이는 deaminase domain의 반응 속도가 너무 빨라 Cas9이 완전한 절단을 일으키지 않는 일시적 결합 상태에서도 편집이 일어날 수 있기 때문일 가능성이 제시되었다. 이 논의는 단순히 “절단이 적은 편집기가 더 안전할 것”이라는 직관만으로는 설명되지 않는, base editing의 고유한 위험성과 설계 변수의 중요성을 잘 보여주었다.

2.4.5. Dowoon Gu, Korea University
- Abasic CRISPR RNAs inherently harness fidelity of SpCas9 for genome editing

구도운 박사는 자연계 CRISPR RNA가 본래 지닌 비표적(off-target) 억제 기작을 바탕으로 CRISPR/Cas9의 guide RNA의 5’말단에 비염기 변형을 도입함으로써 유전체 편집의 효율은 유지하면서도 off-target를 줄일 수 있는 새로운 전략을 제시하였다 [26]. 발표에서는 세균 유래 endogenous CRISPR RNA가 합성 RNA보다 더 우수한 자기/비자기 구별 능력을 보인다는 점에 주목하고, 특히 파지 감염과 산화 스트레스 조건에서 CRISPR RNA의 5′ PAM-distal 영역에 축적되는 산화적 비염기(abasic) 변형의 특징이 이러한 특이성 향상과 관련될 수 있음을 시퀀싱 및 화학적 검출을 통해 설명하였다.

이를 바탕으로 연사는 해당 화학적 특징을 gRNA에 반영하여 비염기 변형을 5’ 말단에 치환하고 연장한 ΦXΦ gRNA 변형을 제안하였다. 이는 on-target 절단은 유지하면서 off-target 절단을 더욱 효과적으로 억제한다는 것을 방대한 규모의 시퀀싱 분석을 통해 입증하였다. 나아가 이러한 설계를 치료 맥락에 적용했을 때 정상 세포에서의 DNA damage와 독성을 줄이면서도 항종양 효과는 유지할 수 있음을 세포주 모델뿐만 아니라 in vivo 모델에서 제시하여, 자연계 CRISPR 시스템의 분자적 원리를 정밀 유전체 편집 기술로 확장한 점이 인상적이었다.

2.5. Session - Therapeutic Application

2.5.1. Yuxuan Wu, YolTech Therapeutics
- Design of Therapeutic Editors Aided by AI and High Throughput Approaches

YolTech Therapeutics의 창업자 Wu 박사의 발표는 연사의 항공기 문제로 인해 원격으로 진행되었다. 발표는 base editor를 실제 임상 제품으로 발전시키기 위해 어떤 요소들이 필요한지를 보여주는 내용이었다. 단순히 editing efficiency를 높이는 데 그치지 않고, bystander editing과 off-target를 줄여 정밀성과 안전성을 함께 개선해야 한다는 점을 강조했고, 이를 위해 AI 기반 후보 발굴과 high-throughput screening, 반복적인 효소 최적화를 결합한 개발 전략을 소개했다.

2.5.2. Micah Benson, KSQ Therapeutics
- CRISPR Screen-Informed Design of T cell Therapies

KSQ Therapeutics의 CSO인 Benson 박사는 CRISPR 스크린을 이용해 암 환자를 위한 T 세포 치료제를 어떻게 합리적으로 설계했는지 bench-to-bedside의 과정을 자세하게 설명하였다. 그는 고형암(solid tumor)에서 T 세포 치료가 잘 작동하지 않는 이유를 종양미세환경의 면역억제성과 표적 항원의 이질성이라는 두 가지 문제로 정리하고, 이를 극복하기 위한 방법으로 in vivo CRISPR 스크린을 활용한 표적 발굴 전략을 제시하였다. 특히 단일 유전자 수준을 넘어 조합 편집까지 확장하여 Regnase-1과 SOCS1이 T 세포의 종양 내 축적, 지속성, 항종양 기능을 크게 높일 수 있는 핵심 조합임을 도출한 과정은, CRISPR 스크린이 단순한 기전 연구 도구를 넘어 실제 치료제 설계의 출발점이 될 수 있음을 잘 보여주었다. 또한 이러한 결과를 인간 TIL과 CAR-T 모델, 나아가 임상 프로그램으로까지 연결해 설명한 점에서, 기초 스크리닝 결과를 어떻게 치료 전략으로 번역할 수 있는지 구체적으로 이해할 수 있었다.

특히 인상적이었던 부분은 치료 표적을 찾는 데서 그치지 않고, 실제 임상 적용을 위해 어떤 guide를 선택할지, 제조 과정에서 어떤 점이 중요한지, 그리고 안전성을 어떤 순서로 검증할지를 모두 CRISPR 스크린과 연결해 설계했다는 점이다. 발표는 T 세포 치료제가 효과를 보이기 위해서는 단순히 세포를 활성화하는 것만으로는 부족하고, 종양미세환경을 포함한 복합적인 요소를 함께 고려해야 한다는 점을 잘 보여주었다. 전반적으로 이번 발표는 CRISPR 기술이 유전자 교정 자체를 넘어서, 세포치료제 개발 전반의 의사결정 체계를 정교하게 만드는 플랫폼으로 작동할 수 있음을 보여준 흥미로운 사례였다. 기초부터 응용까지를 모두 포괄하는 이번 학회의 장점을 다시 한번 확인할 수 있었던 발표였다.

2.5.3. Sarah Pierce, Broad Institute
- Prime Editing-installed Suppressor tRNAs for Disease-Agnostic Genome Editing

Prime-editing 기술을 개발한 David Liu 교수님 연구실의 박사후연구원 Pierce 박사는 질환 비특이적(disease-agonistic) 치료로써 유전체 편집 기술이 어떻게 적용될 수 있는지 suppressor tRNA의 사례를 바탕으로 발표하였다. Pierce 박사는 기존의 Prime-editing을 포함하여 CRISPR 기반의 기술은 특정 돌연변이 특이적으로 작용하는 치료제로서, 유전자 전반에 돌연변이가 흩어져 있는 질병의 경우에는 이를 하나씩 교정하는 것은 매우 비현실적이라는 점을 강조하며 발표를 시작하였다. 따라서 이를 돌연변이의 작동 메커니즘을 기반하여 치료하는 방법에 대해 집중하게 되었는데, Pierce 박사가 주제로 삼은 질병인 CFTR 돌연변이는 premature stop codon을 만들어 단백질 합성을 조기 종료시키는 nonsense mutation이 ~8% 정도를 차지한다고 한다.

Nonsense mutation 관련 질병에 대한 힌트를 suppressor tRNA에서 찾았는데, 이는 stop codon을 인식할 수 있도록 anticodon이 바뀐 tRNA이다. 선행 연구에 따르면 포유류 세포에서 자연적인 stop codon에는 정확한 종결을 유도하는 여러 기전이 있기에 suppressor tRNA가 premature stop codon에서 번역을 진행시키면서도 natural stop codon의 fidelity를 상당 부분 유지할 수 있다고 한다 [27]. 이를 바탕으로 연구진은 prime editing을 이용해 세포 내 endogenous tRNA 유전자 자체를 영구적으로 suppressor tRNA로 전환하는 것을 시도했다 [28]. 즉 개별 질환 돌연변이를 하나씩 직접 교정하는 대신, 번역 기계의 일부를 조정하여 nonsense mutation 전반에 공통적으로 대응할 수 있는 기반을 만들겠다는 발상으로 이해되었다.

인간의 유전자에는 총 418개의 high confidence tRNA 유전자가 존재하는데, 이들은 중복적으로 존재하여 61개의 codon을 담당한다. 또 61개의 codon 중 16개에 대해서는 정확하게 대응하는 tRNA가 없어 wobble position만 다른 pseudo-cognate tRNA들이 이 codon을 담당하고 있다고 한다. 이러한 관점에서 연구진은 일부 tRNA가 suppressor tRNA로서 영구적으로 바뀌더라도 안전할 수 있을 전략이 있을 것이라 판단하여, 이 가운데 어떤 서열이 suppressor tRNA로 전환되기에 적합한지를 대규모로 스크리닝 하였다. 스크리닝 후 추가적인 최적화를 통해 단일 copy 수준에서도 의미 있는 read-through 활성을 보이는 engineered suppressor tRNA를 구축한 과정을 소개하였다. 이는 CRISPR 기반의 prime editing이 단순히 병원성 변이를 원상 복구하는 도구를 넘어, 세포 내 유전정보 해독 시스템 자체를 재설계하는 방향으로도 활용될 수 있음을 보여주는 사례라고 보였다.

또한 이 접근이 실제 질환 모델과 in vivo에서도 기능적 회복으로 이어질 수 있음을 제시하였다. 특히 lysosomal disorder 모델에서 효소 활성 회복과 조직 수준 표현형 개선까지 확인한 결과는, 이 전략이 단순한 개념 증명에 그치지 않고 치료 가능성까지 보여주었다는 점에서 의미가 있었다. 물론 suppressor tRNA가 삽입하는 아미노산이 원래 서열과 항상 일치하지는 않기 때문에 모든 nonsense mutation에 동일하게 적용되기 어렵고, 편집 효율과 전달 방식 역시 여전히 중요한 한계로 남아 있다고 생각된다. 그럼에도 불구하고 이번 발표는 개별 돌연변이를 하나씩 교정하는 기존 정밀 교정의 틀에서 한 걸음 더 나아가, 돌연변이의 공통된 분자적 메커니즘을 겨냥하는 범용적 유전체 치료 전략이 가능할 수 있음을 설득력 있게 보여주었다.

2.5.4. Haihua Chu, Beam Therapeutics
- Unlocking the Potential of base Edited HSCs for Therapeutic Applications with Epitope Engineering

Beam Therapeutics의 Chu 박사의 발표는 base editing 기술을 이용한 세포 치료를 더 안전하고 효율적으로 만들기 위한 방법을 소개하는 내용이었다. 연사는 치료에 사용할 혈액줄기세포를 편집할 때, 치료에 필요한 변이만 넣는 것이 아니라 세포 표면의 일부 단백질도 함께 바꾸어 (epitope engineering), 편집되지 않은 세포는 제거하고 편집된 세포는 더 잘 남도록 하는 전략을 설명하였다. 이는 base editor를 전달하는 과정에서 여러 gRNA를 동시에 넣는 방식으로 구현되었는데, 이런 방식의 epitope engineering은 치료제의 반복 투여 시 치료 대상 세포를 표적 할 수 있게 됨으로써 편집 세포를 점차 농축시킬 수 있는 장점이 있다고 주장하였다. 또한 이 전략은 단순히 in vivo 편집 효율을 높이는 데 그치지 않고, 기존의 독성이 큰 항암 전처리 과정을 대체할 가능성을 제시할 수 있을 것이라고 한다. 연사는 CD117을 표적을 예시로 항체 기반 선택 전략을 통해, 편집된 세포만 선택적으로 생착하도록 유도하려는 접근을 보여주었다. 이러한 개념이 유전체 편집기의 in vivo 전달과도 결합될 수 있다고 제시한 점에서, base editing 기반 세포치료의 적용 범위를 더 넓히려는 방향성을 보여주는 발표였다.

2.5.5. Luigi M Naldini, San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy
- Gene Editing: Therapeutics and Genotoxicity

이번 발표는 유전자 편집 기술을 실제 치료에 적용할 때 단순히 편집 효율만 높이는 것으로는 충분하지 않고, 장기적으로 안전하고 예측 가능한 세포 제품을 만드는 것이 얼마나 중요한지를 보여주는 내용이었다. Naldini 박사는 기존의 gene addition 치료가 이미 많은 성공을 거두었음에도 불구하고, 삽입 위치의 불확실성이나 발현 조절의 한계 같은 문제를 여전히 안고 있다는 점을 짚으면서, 이를 보완할 차세대 전략으로 HDR 기반의 정밀한 유전자 삽입과 selection을 결합한 접근을 소개하였다. 특히 원하는 편집이 일어난 세포만을 골라내거나, 아예 올바르게 편집된 세포만 살아남도록 설계하는 방식은 genome editing을 더 균일하고 안전한 치료제로 연결하려는 방향으로 이해되었다. 전반적으로 이번 발표는 genome editing이 단순한 교정 기술이 아니라, 치료 효율과 유전독성까지 함께 고려한 정교한 세포치료 플랫폼으로 발전하고 있음을 보여주었다.

2.5.6. X. Shawn Liu, Columbia University Medical Center
- Silencing of Pathological Alleles in Inborn Errors Immunity by CRISPR-IMPRINT

Liu 박사는 CRISPR를 이용해 후성유전적 표지를 조절하여 발병원이 되는 대립유전자만 선택적으로 침묵화하려는 접근을 소개하였다. 연사는 Genomic imprinting의 원리에서 착안해 DNA methylation editor를 새롭게 설계하고, 이를 통해 정상 대립유전자는 유지하면서 돌연변이 대립유전자의 발현만 억제하려 했고자 하였다. 실제로 환자 유래 T 세포에서 allele-specific methylation과 기능 회복 가능성을 함께 제시하였고, 이 기술은 돌연변이를 직접 교정하기 어려운 우성 질환에서 하나의 대안적 CRISPR 응용 전략이 될 수 있겠다고 보였다.

2.6. Session - New Editing Modality and Therapeutics

2.6.1. Phoebe A Rice, University of Chicago
- Structural Basis for Directionality of Large Serine Integrases

Rice 교수님은 서열 특이적 DNA 재조합효소로서 Large Serine Recombinase(LSR, 연사는 이를 Large Serine Integrase라고 칭하는 것을 선호한다고 밝혔다.) 계열 단백질의 활용 가능성에 대해 발표하였다. 이 효소는 DNA를 단순히 절단하는 데 그치지 않고, 특정 서열을 인식해 절단하고, 재조합을 유도함으로써 비교적 큰 DNA 조각을 방향성 있게 삽입할 수 있는 점에서 최근 주목을 받고 있는 단백질이다. 발표에서는 특히 LSR가 integration과 excision을 무작위적으로 반복하는 것이 아니라, 기질과 생성물을 구조적으로 구분하고 이를 바탕으로 반응의 방향성을 제어한다는 점이 강조되었다. 단순히 “큰 DNA를 넣을 수 있는 효소”로 이해하고 있던 입장에서, 실제로는 DNA 결합 도메인과 coiled-coil 구조의 배열, 그리고 RDF(recombination directionality factor)에 의해 서로 다른 구조 상태가 만들어지면서 반응 경로가 정교하게 조절된다는 설명이 인상적이었다.

특히 attP와 attB의 차이가 단순한 서열 차이만이 아니라, DNA 결합 도메인의 상대적 위치와 coiled-coil의 배치를 바꾸어 활성 tetramer 형성과 생성물의 재반응 가능성까지 좌우한다는 점은 매우 흥미로웠다. 생성물 상태에서는 coiled-coil이 같은 면으로 모여 구조를 형성하고, 이것이 역반응을 막는다는 점을 구조생물학적으로 보여주었다. 또한 RDF가 단순히 반응을 되돌리는 보조인자가 아니라, 효소가 전혀 다른 구조적 경로를 선택하게 만든다는 점도 LSR 시스템의 조절 방식이 생각보다 훨씬 정교하다는 인상을 주었다.

전반적으로 이번 발표는 LSR를 단순한 유전자 삽입 도구로 보기보다, 방향성과 가역성을 구조적으로 제어할 수 있는 정밀한 재조합 플랫폼으로 이해하게 해 주었다. 특히 어떤 서열 맥락에서 효율과 특이성이 결정되는지, 또 왜 어떤 경우에는 원하는 방향으로만 반응이 진행되는지를 구조 수준에서 설명했다는 점이 의미 있었다. 이번 발표를 포함하여 본 학회에서는 최근 유전자 편집의 연구자들이 다양한 종류의 Recombinase에 다시 관심을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었는데, CRISPR처럼 RNA 기반으로 표적을 바꾸는 시스템과는 다른 성격의 도구이지만, 대형 삽입이나 재배열을 안정적으로 구현하려는 관점에서 앞으로도 충분히 주목할 만한 메커니즘이라고 보인다.

2.6.2. Sébastien Levesque, Boston Children's Hospital - Harvard Medical School
- In Cellulo DNA Assembly for Targeted Genomic Integration and Rearrangement in Human Cells

Bauer 연구실의 Levesque 박사는, 앞서 Erik J. Sontheimer 교수님 발표에서 소개된 Prime Assembly와 유사한 개념의 기술을 발표하였다. 유사한 전략의 엔지니어링이 같은 시기에 bioRxiv에 공개된 점을 고려하면 [29], back-to-back으로 리뷰가 진행 중인 연구가 아닐까 짐작된다. 발표에서는 이 기술이 단순히 큰 DNA donor를 삽입하는 데 그치지 않고, 세포 내에서 여러 donor 조각을 조립해 하나의 삽입체를 만드는 방향으로도(마치 Gibson assembly처럼) 확장될 수 있음을 보여주었다. 이를 통해 4개의 fragment를 조립해 최대 12 kb까지 삽입할 수 있음을 실험적으로 보였다. Bauer 연구실은 single-stranded DNA donor와 double-stranded DNA donor를 모두 활용할 수 있다는 점, 비분열 세포에서도 일정 수준의 삽입이 가능하다는 점, 그리고 이를 이용해 유전자 삽입뿐 아니라 deletion이나 재배열까지 시도할 수 있다는 점을 강조하였다.

이러한 결과는 Prime Assembly가 기존의 HDR 기반 knock-in처럼 분열 중인 세포에만 크게 의존하는 전략과는 다소 다른 성격의 기능의 플랫폼이 될 수 있음을 시사하며, 특히 분열능력이 제한된 세포 등을 대상으로 한 응용 가능성을 확인할 수 있었다. 전반적으로 이번 발표는 앞선 Sontheimer 교수님의 발표와 마찬가지로, prime editing이 더 이상 짧은 서열 교정에만 머무르지 않고 비교적 큰 DNA 조각의 삽입과 조립까지 확장될 수 있음을 보여주었고, 향후 전달 방식과 효율, 작동 기전이 더 정교하게 규명된다면 mutation-agnostic 한 유전자 보완 전략으로도 충분히 발전할 수 있겠다고 느껴졌다.

2.6.3. Holt A Sakai, Broad Institute
- Directed Evolution of Small RNA-stabilizing Motifs that Improve Prime Editing

David Liu 그룹의 Sakai 박사는 prime editing 효율을 높이기 위해 pegRNA를 안정화하는 작은 RNA 모티프를 directed evolution으로 최적화한 연구를 발표하였다. 기존에도 pegRNA의 3′ 말단에 구조화된 RNA 모티프를 붙여 분해를 줄이고 편집 효율을 높이는 전략은 알려져 있었지만 [30], 이번 연구는 그 범위를 훨씬 넓혀 자연계의 다양한 pseudoknot 계열 RNA 구조를 체계적으로 탐색하고, 그 안에서 실제로 더 우수한 모티프를 발굴하려 했다는 점에서 특히 중요하게 느껴졌다. 특히 연구진은 lentivirus 기반의 pegRNA library를 활용한 대규모 스크리닝과 후속 directed evolution을 통해 pegRNA를 총체적으로 최적화하였는데, RNA 구조에 대한 대량 스크리닝 데이터셋을 구축하는 전략 측면에서 배울 점이 많은 연구라고 생각되었다.

발표에서는 wild-type pseudoknot 중에서도 기존 표준처럼 여겨지던 tevopreQ1 [30]에 필적하거나 이를 능가하는 모티프가 발견되었고, 추가적인 변이 도입을 통해 더 향상된 성능을 얻을 수 있음을 제시하였다. 더 나아가 sickle cell 변이 교정이나 in vivo liver editing에서의 적용까지 보여 해당 전략의 적용 가능성을 피력하였다. 아직까지 prime editing은 off-target을 논하기 어려울 정도로 효율을 높이는 것이 중요하다는 것이 중론인데, 이를 극복하기 위해 효소 자체의 개선뿐만 아니라 RNA의 안정성, 구조 등이 크게 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀 CRISPR 기반 기술 개발에 있어 RNA에 대한 연구도 지속적으로 필요하다는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다.

연구진은 새로 발굴한 RNA 모티프들이 왜 세포 내에서 안정한 지에 대한 하나의 원리는 존재하지 않는 듯하다고 설명하였는데, 그럼에도 불구하고 전반적으로 비슷한 pseudoknot 구조를 가지면서도, 각 motif 가 최적화되는 pegRNA 집합 내에서도 상당히 서로 orthogonal 하다고 설명하였다. 즉, 전체적인 2차 구조의 틀은 비슷하지만 세부 염기서열과 pegRNA 서열 간의 관계성에는 아직 밝혀지지 않은 다른 factor가 존재할 것이라고 설명하였다.

2.6.4. Lilly van de Venn, ETH Zurich
- AutoDISCO Enables Sensitive and High-throughput CRISPR/Cas Off-target Detection in Cells and Organisms

Jacob E. Corn 그룹의 Venn 박사는 세포 내에서의 CRISPR-Cas9 off-target를 검출하기 위해 개발된 DISCOVER-seq [31]의 throughput을 높인 새로운 전략인 AutoDISCO를 소개하였다. DIS-COVER-seq은 CRISPR복합체가 DNA를 절단한 뒤 해당 부위에 모이는 MRE11 등의 DNA 복구 단백질을 chi-seq 기반의 기술로 추적함으로써, 실제 세포 안에서 발생한 on-target 및 off-target 절단 부위를 찾아내는 방법이다. 이 방법은 세포가 실제로 경험한 double-strand break의 흔적을 읽는다는 점에서 생물학적 맥락을 잘 반영하는 장점이 있다. 연사는 DISCOVER-seq이 ChIP 기반 접근이라는 특성상 많은 세포 수가 필요하고, 실험 과정이 복잡하며, 비용과 노동력이 많이 든다는 한계가 있어 대규모 스크리닝이나 희귀 세포 집단 분석에는 한계가 있었다고 설명하였다.

연사는 이러한 한계를 줄이기 위해, 기존과 같은 DNA 복구 반응을 이용하되 훨씬 적은 세포 수로도 적용 가능한 방식으로 workflow를 단순화하고 throughput을 높인 AutoDISCO라는 새로운 pipeline을 개발했다고 한다. 발표에서는 정확하게 DISCOVER-seq과 AutoDISCO의 차이점이 무엇인지를 제대로 설명해주지 않았지만, DISCOVER-seq을 low-input에 적합하게 최적화하고 multiplexing 할 수 있도록 barcoding 방법 등을 도입한 것으로 추정된다.

발표의 후반부에는 AutoDISCO를 스크리닝 방법에 적용하였고, 얻어진 데이터셋을 기반으로 off-target을 예측하는 machine learning 모델을 개발했다고 한다. sequence mismatch 정보뿐 아니라 chromatin marker와 같은 후성유전학적 특징까지 통합해 off-target 가능성을 예측하려 했다고 주장하였는데, 이는 기존의 DeepCRISPR [32]와 같은 프로그램에서 도입한 개념으로 Auto-DISCO가 확립한 데이터셋의 장점이 무엇인지를 정확하게 전달해 주었으면 더욱 유익했을 것이라 생각되었다.

2.7. Session - CRISPR Biology

2.7.1. Joseph Bondy-Denomy, University of California, San Francisco
- Mechanisms of CRISPR-Cas Antagonism by Bacteriophages

Bondy-Denomy 교수님은 anti-CRISPR 단백질을 최초로 보고한 2013년 Nature 논문 [33]의 제1저자로, 파지가 CRISPR 면역을 회피하기 위해 사용하는 anti-CRISPR 개념의 확립에 핵심적으로 기여한 연구자이다. 이번 발표는 다른 DNA 표적 방어 시스템들과 달리, CRISPR 시스템은 자기와 비자기를 직접 구분하지 못하는 한계를 가진다는 점에서 시작되었다. 연사에 따르면 CRISPR-Cas 시스템은 외부에서 침입한 phage DNA와 이미 숙주 유전체 내에 삽입된 pro-phage DNA를 본질적으로 완벽하게 구별하지 못한다고 한다. 이때 prophage가 anti-CRISPR를 발현하면 Cas 단백질의 활성이 억제되거나 제거되어, CRISPR가 자신의 유전체 안에 존재하는 prophage를 공격하지 못하게 된다. 발표에서는 특히 anti-CRISPR가 단순히 lytic infection 과정에서 phage의 증식을 돕는 인자가 아니라, lysogeny 상태에서 prophage와 숙주가 함께 유지되는 과정에도 기여할 수 있다는 점이 제시되었다.

이어 연사는 anti-CRISPR의 작동 방식이 단순한 저해에 그치지 않고, Cas 단백질의 양 자체를 감소시키는 방향으로도 작동할 수 있음을 설명하였다. Listeria prophage에서 유래한 anti-CRISPR 단백질들은 Cas9의 DNA 결합을 빠르게 억제하는 방식과, Cas9 단백질을 장기적으로 제거하는 방식을 함께 사용함으로써 prophage에서 유래한 단백질이 박테리아 자기 자신에게도 필요한 공생적인 관계를 보인다고 한다. 유사하게 Cas12 계열에서도 anti-CRISPR가 crRNA 또는 Cas 단백질 축적에 영향을 주는 다양한 방식으로 작동할 수 있다는 점이 소개되었다. 이를 통해 anti-CRISPR는 단순한 CRISPR 저해제가 아니라, 파지와 숙주 사이의 관계를 조정하는 분자적 장치로 제시되었다 [34].

후반부에서는 jumbo phage가 CRISPR를 회피하는 방식이 소개되었다. 발표에 따르면 일부 jumbo phage는 감염 후 자신의 DNA 주변에 nucleus-like compartment를 형성하여, Cas9이나 restriction enzyme과 같은 DNA-targeting 효소가 phage DNA에 접근하지 못하게 한다고 한다 [34]. 이 구조는 세균 세포 내에서 phage 유전체를 물리적으로 분리하는 역할을 하며, phage가 단순히 방어 인자를 억제하는 수준을 넘어 세포 내 공간 자체를 재구성하여 면역을 회피할 수 있음을 보여주었다.

마지막으로 발표에서는 이러한 jumbo phage를 대상으로 한 transposon mutagenesis 전략이 소개되었고, 이를 통해 essential gene과 non-essential gene의 지도를 구축할 수 있다는 점이 설명되었다. 발표자는 phage nucleus 내부로 transposase를 유도하고, 이후 Cas13 기반 선별을 이용하여 삽입 돌연변이 phage들을 분석함으로써 어떤 유전자가 phage replication에 필수적인지 전장 유전체 수준에서 판별할 수 있다고 설명하였다 [35]. 이 접근은 기존처럼 개별 유전자를 하나씩 분석하는 방식이 아니라, 전체 phage genome을 대상으로 기능적 중요도를 체계적으로 평가할 수 있게 한다는 점에서 의미가 있다. 이러한 접근은 2010년대 후반부터 이어진 포유류 시스템에서 특정 기능 필수 유전자를 스크리닝 기반으로 찾아내는 접근이 박테리아 시스템에 확장된 사례로 보여 인상적이었다. 상당히 길고 복잡한 강연이었지만, CRISPR 생물학에 대해 심도 있게 접근할 수 있었던 멋진 강연이었다.

2.7.2. Mitchell R. O'Connell, University of Rochester Medical Center
- Pulling the Plug on Bacteriophage Infection: The Pore Behavior of CRISPR and Anti-phage Defense Associated Membrane Proteins

O’Connell 교수님은 CRISPR-Cas 시스템과 함께 존재하는 막단백질 중 Csx28과 Csx27이 RNA 표적 면역 반응을 어떻게 증폭하는지 설명하였다. Cas13은 표적 RNA를 인식하면 활성화되어 표적 외에도 다양한 RNA들을 절단하는데, 이 절단은 무작위적이지 않고 특정 tRNA, 특히 glycine GCC tRNA와 같은 일부 tRNA의 anticodon loop 부위에서 선택적으로 일어날 수 있다고 제시하였다. 이후 이렇게 생성된 절단 tRNA 산물이 Csx28 같은 막단백질을 활성화하는 신호로 작용하며, 이 과정이 Cas13과 직접적인 단백질-단백질 상호작용이 아니라 RNA 절단 산물을 매개로 이루어진다는 모델을 제안하였다 [36].

이어 발표자는 Csx28이 inner membrane에 존재하는 pore-forming 단백질로 작동하며, Cas13에 의해 생성된 특정 tRNA 절단 산물에 반응해 탈분극을 유도한다고 설명하였다. 이러한 막 전위 붕괴는 ATP 생성에 필요한 전자전달계를 방해하여 파지 감염을 효과적으로 억제하는 것으로 제시되었다. 또한 cryo-EM 분석을 통해 Csx28이 중심에 pore를 가진 올리고머 구조를 형성한다는 점이 소개되었고, liposome 실험과 구조 분석을 통해 tRNA조각이 실제로 이 단백질의 활성화 리간드처럼 작용할 가능성을 제시하였다. 이러한 메커니즘은 일종의 자폭 메커니즘처럼 이해되었는데, 박테리아가 군집 내에서 파지의 증식을 억제하기 위한 적응적 메커니즘의 일종으로 이해할 수 있을 것으로 보였다.

후반부에서는 Csx27 역시 Cas13b와 연관된 또 다른 막단백질로 유사한 기능을 할 수 있음이 소개되었다. Csx27은 구조적으로 Csx28과 전혀 다르지만, Cas13b가 활성화된 조건에서 세포막 탈분극을 유도하고 파지 감염을 억제한다는 점에서 기능적으로는 비슷한 역할을 하는 것으로 나타났다. 발표자는 이러한 단백질들이 특정 CRISPR 시스템의 특이한 부속 인자에 그치지 않고, 더 넓은 anti-phage 시스템 전반에서 공통적으로 사용될 가능성을 제시하였다. 즉, 절단된 tRNA나 다른 핵산 유래 분자가 막단백질을 활성화하고, 그 결과 막 전위 교란을 통해 항바이러스 상태를 유도하는 전략이 다양한 생물학적 방어 시스템에서 반복적으로 활용될 수 있다는 점이 이 발표의 중요한 결론이었다.

2.7.3. Elizabeth Kellogg, St. Jude Children's Research Hospital
- Exploration of target site selection mechanisms and RNA-guided transposons

Kellogg교수님은 RNA-guided transposon의 target 선택 메커니즘과 transposon에서도 발견되는 off-target 인식 원리를 구조생물학과 기능 스크리닝을 결합해 분석한 연구를 소개하였다. 발표에서는 기존 CRISPR-Cas9 기반 편집이 이중가닥 절단에 따른 염색체 재배열이나 세포 독성과 같은 한계를 가질 수 있다는 점을 짚으면서, double-strand break 없이 원하는 위치에 DNA를 삽입할 수 있는 CRISPR-associated transposon (CAST)이 대안적 플랫폼이 될 수 있음을 강조하였다. CAST 시스템이 Tn7 유사 전이인자를 바탕으로 진화해 왔으며, gRNA를 이용해 특정 위치를 인식하면서도 실제 삽입은 다른 단백질 복합체를 통해 수행된다고 한다.

연사는 이 시스템의 활용 가능성을 높이기 위해서는 단순히 integration activity만 볼 것이 아니라 specificity를 함께 정량적으로 평가해야 한다고 주장하였다. 이를 위해 박테리아 기반 dual selection screen을 구축하여 on-target integration과 off-target integration을 구분하고, 각 단백질 변이가 활성과 특이성에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과 transposase인 TnsB의 변이는 주로 활성에 영향을 주는 반면, TnsC의 특정 DNA-contacting region은 활성은 유지하면서도 특이성을 크게 무너뜨릴 수 있음을 제시하여, 핵산을 표적으로 하는 단백질들에서 발견되는 proof-reading 기능이 CAST 시스템에도 있다는 사실을 입증하였다 [37].

후반부에서는 IS110 계열 bridge RNA recombinase와 CAST 시스템을 비교하였다. IS110은 구성 요소가 단순해 공학적으로 매력적이지만, 실제로는 상당한 off-target hotspot을 보일 수 있다고 한다. 이에 비해 CAST 시스템은 비교적 높은 on-target integration을 보여 IS110에 비해서는 복잡하지만 상대적으로 더 정확한 integration 플랫폼으로 사용할 수 있음을 강조하였다. CRISPR-Cas의 다음 세대로서 RNA-guided programmable DNA insertion 기술들이 자연계에서 발굴되어 기술적으로 최적화되고 있다는 점을 확인할 수 있어서 인상 깊었다.

2.8. 네트워킹 프로그램 

2.8.1. Social Night 

Keystone Symposia의 가장 큰 강점 중 하나는 학문적 교류를 넘어선 인적 네트워킹 기회이다. 학회 첫날 저녁에는 Social Night 행사가 개최되어 전 세계 연구자들과 와인, 맥주와 함께 대화를 나눌 수 있었다. 처음에는 낯선 환경이었지만, 같은 연구 주제에 관심을 가진 연구자들과 자연스럽게 대화가 이어지며 학문적으로 즐거운 교류를 할 수 있었다.

특히 Social Night에서는 여러 역사적인 교수님들과 대화를 할 수 있는 기회도 있었다. 예를 들어 Erik Sontheimer 교수님(필자는 miRNA와 RNA의 화학적 변형 전공자로, Erik 교수님의 2000년대 초반 리뷰 논문으로 석사 시절을 시작했기에 연예인을 뵙는 기분이었다.)의 말씀에 따르면, Keystone은 아주 특수 영역의 깊고 좁은 사회를 구축하는 것을 지향한다고 한다. 그래서 그런지 학회에 계신 상당수의 분들이 서로 친분이 있는 것처럼 보였다. 아울러 이 기회를 통해 좋은 네트워킹을 하도록 조언해 주시며, 앞으로의 과학자로서의 길을 격려해 주셨다.

또 한국에서는 경험하기 어려웠던 세계적인 RNA Therapeutics 분야 기업들의 박사님들과 그들이 준비한 부스를 경험할 수 있었다. 특히 ADViRNA사에서 알게 된 박사님으로부터 "I love RNA"라 쓰인 스티커를 받았는데, 이를 명찰에 붙이고 다니니 모르는 학생들과 박사님들이 그 스티커를 통해 말문을 트는 계기가 되어 상당히 유용했다. 한국의 학회에서는 경험하기 힘들었던, 매우 외향적인 사람들의 모임 같았던 개막이었다. 후문으로는 과학자들은 기본적으로 내향적이나, Keystone 학회에 참석하는 사람들은 워낙 과학을 사랑하는 이들이 많아 피나게 노력하는 것이라는 어느 교수님의 말씀도 있었다. 그러니 “JUST TRY!”라고 하셨다.

그림 2. Social night 현황

2.8.2. Poster Session

필자는 이번 학회에 포스터 발표자로 참가하였다. 발표 제목은 “Deep Learning-Based Design of Bio-Inspired Abasic gRNAs for Specific CRISPR-Cas9 Genome Editing”이었으며, 앞선 발표 세션에서 소개된 구도운 박사님(2.4.5.)과의 공동연구 내용을 다루었다. 이 연구의 출발점은 “박테리아는 과연 CRISPR 면역 체계에 의해 완전히 안전할 수 있는가?”라는 질문이었다. 이번 학회에서 anti-CRISPR를 깊이 있게 다룬 Bondy-Denomy 교수님(2.7.1.)의 발표에서도 언급되었듯, CRISPR 시스템은 다른 DNA 표적 시스템과 달리 자기와 비자기를 구분하는 명확한 원리가 잘 알려져 있지 않다. 그렇다면 박테리아는 항상 고질적인 자가면역질환에 노출되어 있지 않을까 하는 상상에서 프로젝트를 시작하였다. 당시 우리 연구실에서는 비염기 변형(abasic site), 즉 염기가 소실된 뉴클레오타이드를 활용하여 siRNA의 off-target 효과를 억제하는 연구 [38]를 진행하고 있었다. 필자는 여기에서 한 걸음 더 나아가, 이러한 변형이 단순한 인공적 조절 수단이 아니라 자연계에서도 기능적으로 활용될 수 있지 않을까 상상하게 되었다. 비염기 변형은 자연 상태에서 과도한 산화 스트레스에 의해 핵산의 염기가 탈락하면서 형성될 수 있으며, miRNA나 CRISPR RNA와 같이 RNA 기반으로 표적을 인식하는 시스템에서 필연적으로 제기되는 off-target 문제를 완화하는 데 관여할 가능성이 있다고 보았다. 즉, 활성산소(ROS)와 그 결과로 형성되는 비염기 변형이 RNA 기반 표적화 시스템의 정확도를 조절하는 하나의 생물학적 메커니즘이 될 수 있다는 가설이었다.

대장균에서 박테리오파지 감염 시 세포 내 활성산소가 급격히 증가한다는 보고[39]는 이러한 가설에 중요한 착안점을 제공하였다. 당시 포유동물 시스템에서 비염기 변형의 역할을 연구하던 필자는, 이러한 산화적 환경이 박테리아의 CRISPR RNA에도 영향을 미칠 수 있으며, 그 결과 CRISPR-Cas9의 표적 특이성에도 일정한 기능적 의미를 부여할 수 있을 것이라고 생각하였다. 다시 말해, 비염기 변형은 단순한 손상이 아니라, 특정 상황에서 off-target 절단을 줄이고 자기 유전체에 대한 불필요한 공격을 완화하는 방향으로 작용할 가능성이 있다고 보았다. 이러한 가설을 바탕으로, RNA 변형 기반 엔지니어링을 중점적으로 수행해 오신 구도운 박사님과 협업하여 자연적인 abasic 변형 메커니즘에서 착안한 abasic gRNA를 설계하고, 이를 치료 응용에 보다 적합한 형태로 확장하기 위해 딥러닝 기반 설계 전략을 접목한 연구[26]를 진행하였고, 지난 2월 해당 논문이 출판되어 이번 학회에 처음으로 논문의 내용을 자세히 소개할 기회를 가졌다.

포스터 발표 시간 동안 여러 연구자들로부터 활발한 질의와 토론이 이루어졌으며, 특히 off-target 예측 모델의 training data 구성과 실험적 검증 방법론에 대한 심층 질문을 받아 한층 성장할 수 있는 기회였다. 또 개인적으로 가장 인상 깊은 순간은 Jennifer Doudna 교수님께서 포스터 세션 중 직접 찾아와 10분가량 경청해 주시며 여러 질문을 주셨다. 발표가 끝나고 "Wonderful talk!"이라 하시며 학생인지, 졸업은 언제냐고 물어보셔서, 고생스러운 연구의 날들을 보상받는 감동을 받았다. 여러 학회에서 포스터 발표는 상당히 자주 참여했지만, Keystone 학회만큼 과학적 소통이 적극적으로 이루어지는 경우는 거의 처음이었다. 견습 과학자로서 진심인 학생들과 사명감이 있는 과학자들이 모여 과학을 논하는 멋있는 자리였다.

2.8.3. Carrer Roundtable (Joint)

이번 Keystone Symposia의 Carrer Ronudtable 세션에는 Cell Press의 Senior Scientific Editor인 Kusumika Mukherjee, Acuitas Therapeutics의 Chief Scientific Officer인 Ying Tam, Vertex Pharmaceuticals의 Zachary Zappala, 그리고 Memorial Sloan Kettering Cancer Center의 Ralph J. Garippa가 멘토로 참석하였다. 이 세션은 각 멘토가 일방적으로 발표하는 형식이라기보다 각 테이블을 돌며 참가자들과 직접 이야기를 나누는 방식으로 진행되었다. 생명과학 및 공학 분야에서 훈련받은 연구자들이 저널, 학계, 산업계 등 서로 다른 진로에서 어떤 역할을 수행하고 있는지를 한 자리에서 접할 수 있었다.

참석자 대부분이 박사과정 학생이나 초기 박사후연구원들로 구성되었고, 연구를 계속 학계에서 이어갈지, 산업계로 방향을 넓힐지, 혹은 저널이나 다른 과학 커뮤니케이션 관련 진로를 고려할지와 같은 현실적인 질문들이 자연스럽게 오갔다. 이론적인 조언보다는 각자의 경로에서 체감한 경험을 바탕으로 한 답변이 주를 이뤄 유익하였다.

그림 3. 포스터 세션 현황

3. 총평

이번 Keystone Symposia 2026은 정밀 유전체 편집 분야가 하나의 분명한 전환점에 들어섰음을 보여준 학회였다. 초기 CRISPR 시대가 원하는 위치의 DNA를 정확히 절단하고 짧은 서열을 교정할 수 있다는 가능성을 입증하는 단계였다면, 현재의 유전체 공학은 그 이후의 질문, 즉 더 큰 DNA를 어떻게 삽입할 것인지, 복잡한 구조 재배열을 어떻게 설계할 것인지, 그리고 이러한 기술을 실제 치료 전략으로 어떻게 연결할 것인지에 집중하고 있었다. 실제로 이번 학회에서는 Cas9 중심의 편집 기술이 TnpB, GeoCas9과 같은 보다 작고 전달 친화적인 형태로 최적화되는 한편, base editing, prime editing, prime assembly와 같은 기술이 정밀 교정을 넘어 보다 큰 삽입과 복합적인 유전체 설계를 지향하는 방향으로 확장되고 있음을 확인할 수 있었다. 여기에 더해 bridge recombinase, CAST, DRT와 같은 새로운 삽입 및 재배열 모달리티가 자연계에서 발굴되면서, 앞으로의 유전체 편집 기술은 더 이상 “어디를 자를 것인가”에만 머무르지 않고 “무엇을 어떻게 넣고 다시 설계할 것인가”를 중심으로 발전해 나갈 것이라는 점이 분명하게 드러났다.

또한 이번 학회는 유전체 편집이 단순한 분자생물학적 도구를 넘어, 보다 넓은 치료 전략과 생물학적 발견의 플랫폼으로 확장되고 있음을 보여주었다는 점에서도 의미가 컸다. 특정 변이를 하나씩 교정하는 접근을 넘어 보다 넓은 환자군에 적용 가능한 범용적 치료 전략이 논의되었고, 이를 위해 편집기 자체의 효율뿐 아니라 전달체의 조직 선택성, 세포 표적화, 안전성, 반복 투여 가능성과 같은 실제 임상 번역의 문제들이 함께 다루어졌다. 더 나아가 CRISPR 기반의 대규모 스크리닝과 머신러닝/AI의 결합은 유전자 기능 해석과 편집기 및 치료제 후보의 발굴 및 최적화를 한층 빠르고 정교하게 만들고 있었으며, 이는 앞으로의 연구가 실험과 계산의 긴밀한 통합 속에서 가속화될 것임을 시사하였다. 종합하면, 정밀 유전체 편집 분야는 이제 기초과학의 상징적 기술을 넘어 삽입과 재배열, 전달과 안전성, 스크리닝과 예측을 모두 포괄하는 보다 성숙한 단계로 이동하고 있으며, 향후에는 자연계에서 발굴된 새로운 분자기계와 AI 기반 설계 전략이 결합되면서 연구와 치료의 양 측면에서 더욱 빠른 발전이 이루어질 것으로 기대된다.

 [AI 도구 활용 내역] [AI 도구 활용 내역] 전체 원고 작성 후 OpenAI(2026), ChatGPT(GPT-5.4 Thingking)의 피드백을 받아 퇴고 과정을 거쳤습니다. 제시된 수정 의견은 저자의 검토와 판단하에 최종 편집되었습니다. 

4. 참고문헌

==>첨부파일(PDF) 참조