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크리스퍼 유전자가위의 한계를 넘은 고효율 다중 유전체 편집 기술 개발
Bio통신원(한국생명공학연구원 )
- 등록2025.04.24
- 조회7701
- 리보자임(RiboJ)을 이용한 가이드 RNA의 효율적인 합성과 반복적 배열로 크리스퍼 유전자가위의 다중 유전체 편집 효율 향상
- 바이오파운드리 기반의 자동화된 유전자 설계·합성·검증시스템에 적합하여 향후 의료·산업용 균주 개발에 적용 가능할 것으로 기대
크리스퍼(CRISPR) 유전자가위 기술은 특정 유전자만 정확하게 골라내어 편집할 수 있는 높은 정밀도를 가지고 있어 생명공학 분야의 혁신적인 기술로 주목받고 있다. 크리스퍼 기반 유전자 편집 기술을 이용해 여러 유전자를 동시에 편집할 경우 카스(Cas) 단백질이 해당 유전자들에게 도달하도록 가이드 역할을 하는 sgRNA(single-guide RNA)를 편집하고자 하는 유전자 개수만큼 반복해서 배열해야 한다. 그러나 해당 sgRNA들의 서열이 매우 유사하여 반복적으로 배열할 경우 DNA 합성 실패, 플라스미드 불안정성, 재조합 오류 등이 빈번하게 발생하는 한계점을 갖고 있다.
한국생명공학연구원(원장 권석윤, 이하 생명연) 합성생물학연구센터 이대희 박사 연구팀은 합성생물학 기술을 바탕으로 새로운 sgRNA 배열 방식을 개발하여 유전자 편집의 효율성과 안정성을 크게 높이고 기존의 병목 현상을 해결할 수 있는 고효율 다중 유전자 편집 기술을 개발했다고 밝혔다.
연구팀은 외부의 유도물질 없이도 스스로 RNA를 절단할 수 있고, 주변 유전자의 영향을 받지 않으면서도 정확하고 안정적으로 sgRNA를 발현할 수 있는 리보자임(RiboJ) 기술을 활용했다. 이를 통해 여러 개의 sgRNA를 효율적으로 처리하는 RAMBE(RiboJ-Aided Multiplexed Base Editing) 시스템과 반복되는 유전자를 서열 없이 배열할 수 있는 NR(Non-Repetitive)-RAMBE 시스템을 개발했다.
해당 기술을 대장균에 적용해 실험한 결과 한 번에 6개 이상의 유전자를 동시에 편집할 수 있어 부티르산 생산량을 최대 7배 증가시켰으며, 아세트산 소비도 조절하여 전체 대사경로 최적화에도 성공하였다.
연구에 사용된 균주는 사람의 장내 환경과 유사한 조건에서도 잘 자라는 프로바이오틱스 활용 대장균(E. coli Nissle 1917)으로 산소가 매우 적은 환경에서도 안정적인 생산성과 편집 효율을 보여 실용화 가능성을 높였다.
특히 NR-RAMBE 시스템은 기존 RAMBE보다 더욱 진화된 방식으로 sgRNA의 반복 서열이 제거되어 DNA 합성과 조립 과정이 훨씬 단순해졌고, 유전자 합성의 복잡성이 약 7배 줄어 유전자 편집의 실패율도 대폭 감소하였다.
이번 실험에서 주목할 점은 유전자를 동시에 6개까지 편집했음에도 기존 시스템과 비슷한 수준의 높은 편집 효율을 보여줬다는 것이다.
이번에 개발한 NR-RAMBE 기술은 sgRNA를 코딩하는 DNA를 안정적으로 합성할 수 있어 바이오파운드리(유전자 설계부터 합성, 검증까지 자동화하는 시스템)와 같은 첨단 유전체 기술에 적합하며, 다양한 의료용, 산업용 미생물 개발에도 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
연구책임자인 이대희 박사는 “크리스퍼 유전자가위를 이용해 여러 개의 유전자를 동시에 편집할 때 가장 문제가 되었던 sgRNA의 합성과 배열 문제를 합성생물학 기술을 이용해 해결했다는 점에서 큰 의미가 있다”라고 밝혔으며, 공동 연구책임자인 이승구 박사는 “이번 기술은 유전자 편집을 세포 내에서 논리적으로 조절할 수 있다는 가능성을 보여준 사례”라고 강조했다.
이번 연구는 2025년 4월 7일 합성생물학 분야의 세계적인 국제학술지 Chemical Engineering Journal (IF 13.4, JCR 상위 2.8%) 온라인 판에 게재되었으며, (논문명 : RiboJ-assisted non-repeated sgRNA arrays for enhanced CRISPR multiplex genome engineering in Escherichia coli / 교신저자 : 이대희·이승구 박사 / 제1저자 : 우승균·김성근 박사 ) 본 연구는 과기정통부 바이오·의료기술개발사업과 생명연 주요사업의 지원으로 수행되었다.
연 구 결 과 개 요
□ 연구배경
○ 크리스퍼(CRISPR) 기반 유전자 편집 기술은 단일 유전자에 대한 정밀 편집에서는 매우 효과적이지만, 다중 유전자 편집에서는 sgRNA 반복 배열로 인한 기술적 제약이 존재한다.
○ 반복적인 sgRNA 배열은 DNA 합성의 실패율을 높이고, 플라스미드 재조합 및 발현의 불안정성을 유발하여 다중 편집의 확장성과 실용화에 한계를 초래한다.
□ 연구내용
○ RiboJ 리보자임을 활용한 sgRNA 배열 시스템(RAMBE) 및 반복 서열을 제거한 비반복 sgRNA 배열 시스템(NR-RAMBE) 개발
○ 대장균 EcN에서 최대 6개 유전자의 동시 편집에 성공, 유전자에 따라 편집 효율 최대 100% 달성
○ 부티르산 생합성 관련 유전자들을 동시에 편집하여 생산성 7배 향상, 아세트산 소비 효율화를 통해 대사경로 최적화 달성
○ NR-RAMBE를 통해 반복 서열 제거 및 유전자 합성 복잡성 약 7배 감소, DNA 합성 성공률과 유전적 안정성 향상
□ 연구성과의 의미
○ 반복 서열 없이도 높은 편집 효율을 유지하는 시스템을 구현함으로써, 다중 유전자 편집 기술의 실용화를 가로막던 핵심 기술 장벽을 제거함
○ EcN과 같은 프로바이오틱스를 포함한 치료용 및 산업용 미생물의 정밀 개량에 활용 가능, 고효율 바이오생산 플랫폼 기술 확장에 기여함
○ 마이크로에어로빅 등 장내 환경 유사 조건에서도 유전적 안정성과 생산성이 유지됨을 통해, 실제 응용 가능성을 실험적으로 검증함
○ 반복 서열을 제거하고 유전자 합성 복잡성을 약 7배 줄인 NR-RAMBE는, 높은 다중 유전자 편집 효율을 유지하면서도 DNA 합성과 조립이 용이한 구조로 설계되었음.
○ 바이오파운드리 기반의 자동화된 유전자 설계·합성·검증(Design–Build–Test–Learn) 시스템에 적합한 차세대 유전체 편집 기술임. 이러한 특성 덕분에, 다양한 의료 및 산업용 미생물 개량에도 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대됨.
연 구 결 과 문 답
이번 성과 뭐가 다른가
이번 연구는 기존 다중 sgRNA 배열 시스템의 반복 서열 의존으로 인한 DNA 합성 실패와 플라스미드 불안정성 문제를 근본적으로 개선했다는 점에서 차별성을 지닌다. 연구팀이 개발한 비반복 sgRNA 배열 시스템(NR-RAMBE)은 반복 서열 없이도 최대 6개의 유전자를 동시에 편집할 수 있으며, DNA 합성과 유전적 안정성 모두에서 큰 향상을 보였다.
어디에 쓸 수 있나
해당 기술은 미생물 기반 바이오의약품, 바이오연료, 바이오소재 등 고부가가치 바이오제품 생산을 위한 균주 유전체 편집에 활용 가능한 범용 플랫폼 기술이다. 특히 미생물 세포공장을 이용한 대사산물 생산과 치료용 프로바이오틱스 개발 등 차세대 합성생물학 응용에도 효과적으로 활용될 수 있다.
실용화까지 필요한 시간은
해당 기술은 이미 대장균 모델에서 높은 효율성과 안정성이 입증되었으며, 기술이전 및 후속 응용 연구에 바로 활용 가능한 단계이다. 현재 단계에서도 기술이전이 가능하고, 산업용 균주 개발에 즉시 활용할 수 있다.
실용화를 위한 과제는
향후 다양한 균주와 대사산물 생산 경로에의 적용을 통해 기술의 범용성을 확장하고, 진핵세포에서도 시스템이 안정적으로 작동함을 실증하는 것이 실용화를 위한 주요 과제이다.
연구를 시작한 계기는
CRISPR 유전자가위 기술은 생명과학 및 바이오산업 전반에서 여러 유전자를 동시에 조절하거나 제거하는 데 널리 활용되고 있다. 그러나 다중 유전자 편집을 위해 여러 sgRNA를 배열하는 과정에서 반복 서열이 필연적으로 포함되고, 이로 인해 DNA 합성 실패, 플라스미드 재조합, sgRNA 발현 불안정성 등의 문제가 발생해 왔다. 이러한 기술적 한계를 극복하고, 보다 안정적이고 확장성 있는 편집 시스템을 구축하기 위해 비반복 sgRNA 배열 시스템을 개발하게 되었다.
에피소드가 있다면
sgRNA 배열의 반복 문제를 해결하기 위해 다양한 리보자임과 sgRNA 핸들 변형을 조합하고, 이를 검증하기 위해 수십 종의 변형체를 제작해 편집 효율을 직접 비교하는 실험을 반복했다. 초기에는 실패도 많았지만, 점차 최적 설계를 찾아가며 NR-RAMBE 시스템을 완성했을 때의 성취감이 컸다.
꼭 이루고 싶은 목표는
이번 기술을 기반으로, 반복 서열로 인한 유전자 편집 시스템의 제약을 근본적으로 해소하고, 다양한 생물종에서의 안정적이고 효율적인 다중 유전체 조작이 가능한 범용 플랫폼을 구축하는 것이 궁극적인 목표이다.
신진연구자를 위한 한마디
도전적인 아이디어를 두려워하기보다, 그것을 돌파하려는 열정과 용기를 가지고 시작한다면 어떤 어려움도 극복할 수 있을 것이라 생각합니다. 비록 지금은 불확실한 미래가 두렵고 걱정될 수 있지만, 그 안에서도 자신을 믿고 한 걸음씩 앞으로 나아가며 도전을 이어가시길 바랍니다.
□ 연구배경
○ 크리스퍼(CRISPR) 기반 유전자 편집 기술은 단일 유전자에 대한 정밀 편집에서는 매우 효과적이지만, 다중 유전자 편집에서는 sgRNA 반복 배열로 인한 기술적 제약이 존재한다.
○ 반복적인 sgRNA 배열은 DNA 합성의 실패율을 높이고, 플라스미드 재조합 및 발현의 불안정성을 유발하여 다중 편집의 확장성과 실용화에 한계를 초래한다.
□ 연구내용
○ RiboJ 리보자임을 활용한 sgRNA 배열 시스템(RAMBE) 및 반복 서열을 제거한 비반복 sgRNA 배열 시스템(NR-RAMBE) 개발
○ 대장균 EcN에서 최대 6개 유전자의 동시 편집에 성공, 유전자에 따라 편집 효율 최대 100% 달성
○ 부티르산 생합성 관련 유전자들을 동시에 편집하여 생산성 7배 향상, 아세트산 소비 효율화를 통해 대사경로 최적화 달성
○ NR-RAMBE를 통해 반복 서열 제거 및 유전자 합성 복잡성 약 7배 감소, DNA 합성 성공률과 유전적 안정성 향상
□ 연구성과의 의미
○ 반복 서열 없이도 높은 편집 효율을 유지하는 시스템을 구현함으로써, 다중 유전자 편집 기술의 실용화를 가로막던 핵심 기술 장벽을 제거함
○ EcN과 같은 프로바이오틱스를 포함한 치료용 및 산업용 미생물의 정밀 개량에 활용 가능, 고효율 바이오생산 플랫폼 기술 확장에 기여함
○ 마이크로에어로빅 등 장내 환경 유사 조건에서도 유전적 안정성과 생산성이 유지됨을 통해, 실제 응용 가능성을 실험적으로 검증함
○ 반복 서열을 제거하고 유전자 합성 복잡성을 약 7배 줄인 NR-RAMBE는, 높은 다중 유전자 편집 효율을 유지하면서도 DNA 합성과 조립이 용이한 구조로 설계되었음.
○ 바이오파운드리 기반의 자동화된 유전자 설계·합성·검증(Design–Build–Test–Learn) 시스템에 적합한 차세대 유전체 편집 기술임. 이러한 특성 덕분에, 다양한 의료 및 산업용 미생물 개량에도 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대됨.
연 구 결 과 문 답
이번 성과 뭐가 다른가
이번 연구는 기존 다중 sgRNA 배열 시스템의 반복 서열 의존으로 인한 DNA 합성 실패와 플라스미드 불안정성 문제를 근본적으로 개선했다는 점에서 차별성을 지닌다. 연구팀이 개발한 비반복 sgRNA 배열 시스템(NR-RAMBE)은 반복 서열 없이도 최대 6개의 유전자를 동시에 편집할 수 있으며, DNA 합성과 유전적 안정성 모두에서 큰 향상을 보였다.
어디에 쓸 수 있나
해당 기술은 미생물 기반 바이오의약품, 바이오연료, 바이오소재 등 고부가가치 바이오제품 생산을 위한 균주 유전체 편집에 활용 가능한 범용 플랫폼 기술이다. 특히 미생물 세포공장을 이용한 대사산물 생산과 치료용 프로바이오틱스 개발 등 차세대 합성생물학 응용에도 효과적으로 활용될 수 있다.
실용화까지 필요한 시간은
해당 기술은 이미 대장균 모델에서 높은 효율성과 안정성이 입증되었으며, 기술이전 및 후속 응용 연구에 바로 활용 가능한 단계이다. 현재 단계에서도 기술이전이 가능하고, 산업용 균주 개발에 즉시 활용할 수 있다.
실용화를 위한 과제는
향후 다양한 균주와 대사산물 생산 경로에의 적용을 통해 기술의 범용성을 확장하고, 진핵세포에서도 시스템이 안정적으로 작동함을 실증하는 것이 실용화를 위한 주요 과제이다.
연구를 시작한 계기는
CRISPR 유전자가위 기술은 생명과학 및 바이오산업 전반에서 여러 유전자를 동시에 조절하거나 제거하는 데 널리 활용되고 있다. 그러나 다중 유전자 편집을 위해 여러 sgRNA를 배열하는 과정에서 반복 서열이 필연적으로 포함되고, 이로 인해 DNA 합성 실패, 플라스미드 재조합, sgRNA 발현 불안정성 등의 문제가 발생해 왔다. 이러한 기술적 한계를 극복하고, 보다 안정적이고 확장성 있는 편집 시스템을 구축하기 위해 비반복 sgRNA 배열 시스템을 개발하게 되었다.
에피소드가 있다면
sgRNA 배열의 반복 문제를 해결하기 위해 다양한 리보자임과 sgRNA 핸들 변형을 조합하고, 이를 검증하기 위해 수십 종의 변형체를 제작해 편집 효율을 직접 비교하는 실험을 반복했다. 초기에는 실패도 많았지만, 점차 최적 설계를 찾아가며 NR-RAMBE 시스템을 완성했을 때의 성취감이 컸다.
꼭 이루고 싶은 목표는
이번 기술을 기반으로, 반복 서열로 인한 유전자 편집 시스템의 제약을 근본적으로 해소하고, 다양한 생물종에서의 안정적이고 효율적인 다중 유전체 조작이 가능한 범용 플랫폼을 구축하는 것이 궁극적인 목표이다.
신진연구자를 위한 한마디
도전적인 아이디어를 두려워하기보다, 그것을 돌파하려는 열정과 용기를 가지고 시작한다면 어떤 어려움도 극복할 수 있을 것이라 생각합니다. 비록 지금은 불확실한 미래가 두렵고 걱정될 수 있지만, 그 안에서도 자신을 믿고 한 걸음씩 앞으로 나아가며 도전을 이어가시길 바랍니다.
그림 1. RAMBE 시스템을 이용한 프로바이오틱스 대장균 EcN의 4개 유전자 동시 편집 및 대사산물 분석 [사진=한국생명공학연구원]
가) RAMBE 시스템은 RiboJ 리보자임과 sgRNA를 결합한 배열(RiboJ-sgRNA)을 설계하여, 전사 후 자가 절단을 통해 하나의 전사체에서 기능성 sgRNA를 개별적으로 생성하는 플랫폼임. 이 배열은 BE3 단백질과 함께 발현되어 사이토신(Cytosine, C)을 티민(Thymine, T)으로 변환하는 염기편집을 유도함.
나) 표적 유전자인 ldhA, adhE, frdA, pta는 포도당 대사 과정에서 부산물 생성을 유도하는 유전자로, 각각 젖산, 에탄올, 숙신산, 아세트산 생성에 관여함.
다) 반복적인 RiboJ 리보자임, sgRNA 스캐폴드, 유전자 특이적 스페이서로 구성된 배열을 통해 4개의 유전자에 조기 종결 코돈을 도입하고자 사이토신(C)을 티민(T)으로 변환하였으며, 모든 표적에서 높은 편집 효율을 확인함.
라) 부티르산 생산 유전자(atoB, hbd, crt, ter, tesB)를 포함한 이종 생합성 플라스미드를 도입한 후, 편집 균주(EcNΔLAFP)와 대조 균주(EcNWT)의 대사산물 생산을 비교함. 편집 균주는 대조 균주 대비 부티르산(butyrate) 생산이 최대 7배 이상 증가하고, 젖산(lactate)·에탄올(ethanol)·아세트산(acetate)·숙신산(succinate)의 생성은 감소하여 탄소 흐름이 효과적으로 재설계되었음을 확인함.
그림 2. RAMBE 시스템을 이용한 프로바이오틱스 대장균 EcN의 6개 유전자 동시 편집 및 아세트산 기반 생장 분석 [사진=한국생명공학연구원]
가) RAMBE 시스템을 활용하여 대장균 EcN의 6개 유전자(ldhA, adhE, frdA, pta, cspC, patZ)에 조기 종결 코돈을 도입함으로써, 포도당 유래 부산물 생성 경로를 차단하고 아세트산 활용 경로를 강화하는 탄소 흐름 재설계 모식도.
나) 반복적인 RiboJ 리보자임, sgRNA 스캐폴드, 유전자 특이적 스페이서로 구성된 배열을 통해 6개의 유전자에 조기 종결 코돈을 도입하였으며, 일부 표적을 제외하고 대부분의 유전자에서 높은 편집 효율을 확인함.
다) 아세트산을 유일한 탄소원으로 제공한 M9 최소배지 조건에서, 편집 균주(EcNΔLAFPCP)는 기존에 아세트산 활용이 가능한 것으로 보고된 균주(DSM01ΔCP)와 유사한 수준의 안정적인 생장을 나타냄. 이를 통해 RAMBE 기반 편집 균주의 아세트산 대사 경로가 성공적으로 재설계되었음을 확인함.
그림 3. NR-RAMBE 시스템 개발을 위한 염기편집 활성 분석 및 구성요소 최적화 [사진=한국생명공학연구원]
가) BE3와 RiboJ-sgRNA가 유도물질에 반응하는 프로모터에 의해 발현되며, 형광 단백질 리포터 유전자를 포함한 유전자 회로를 통해 염기편집 활성을 감지하는 시스템 모식도. 형광 단백질 유전자는 비활성화된 ACG 시작 코돈을 포함하고 있으며, 염기편집을 통해 ACG가 ATG로 변환될 경우 형광 단백질의 발현이 유도됨. 이를 통해 염기편집 활성은 형광 신호로 정량화됨.
나) 다양한 리보자임의 염기편집 활성을 비교 평가한 결과. 형광 단백질 발현율을 유세포 분석기를 통해 측정하였으며, 일부 리보자임은 기존 RiboJ와 유사하거나 더 높은 활성도를 보임.
다) sgRNA 스캐폴드 서열을 다양하게 변형하여 반복 서열을 줄이면서도 편집 효율이 유지되는 조합을 선별하기 위한 대규모 스크리닝 결과. 총 72종의 변형 sgRNA 스캐폴드 중 일부는 높은 형광 단백질 발현율을 보이며, 효율 저하 없이 반복 서열을 최소화할 수 있는 구성을 확인함.
그림 4. NR-RAMBE 시스템의 개발 및 반복 서열 비교 분석 [사진=한국생명공학연구원]
가) 기존 RAMBE(R6)는 동일한 RiboJ-sgRNA 모듈을 반복 배열한 구조인 반면, NR-RAMBE(N6)는 서로 다른 리보자임과 변형된 sgRNA 스캐폴드를 조합하여 반복 서열 없이 설계된 비반복 배열임.
나) RAMBE(R6)와 NR-RAMBE(N6)를 각각 활용해 6개 유전자(ldhA, adhE, frdA, pta, cspC, patZ)를 동시에 편집한 결과, NR-RAMBE는 대부분의 표적에서 기존 RAMBE와 유사한 수준의 높은 편집 효율을 유지하였음. 이를 통해 반복 서열 없이도 정확한 sgRNA 처리 및 고효율 편집이 가능함을 확인함.
다) 반복 서열을 분석한 결과, RAMBE(R6)는 약 1,026bp의 직렬 반복(tandem repeat)과 918bp의 산재 반복(interspersed repeat) 등 총 1,944bp의 반복 서열을 포함하지만, NR-RAMBE(N6)는 이를 약 194bp로 줄여 DNA 합성의 안정성과 효율을 크게 향상시켰음.
가) RAMBE 시스템은 RiboJ 리보자임과 sgRNA를 결합한 배열(RiboJ-sgRNA)을 설계하여, 전사 후 자가 절단을 통해 하나의 전사체에서 기능성 sgRNA를 개별적으로 생성하는 플랫폼임. 이 배열은 BE3 단백질과 함께 발현되어 사이토신(Cytosine, C)을 티민(Thymine, T)으로 변환하는 염기편집을 유도함.
나) 표적 유전자인 ldhA, adhE, frdA, pta는 포도당 대사 과정에서 부산물 생성을 유도하는 유전자로, 각각 젖산, 에탄올, 숙신산, 아세트산 생성에 관여함.
다) 반복적인 RiboJ 리보자임, sgRNA 스캐폴드, 유전자 특이적 스페이서로 구성된 배열을 통해 4개의 유전자에 조기 종결 코돈을 도입하고자 사이토신(C)을 티민(T)으로 변환하였으며, 모든 표적에서 높은 편집 효율을 확인함.
라) 부티르산 생산 유전자(atoB, hbd, crt, ter, tesB)를 포함한 이종 생합성 플라스미드를 도입한 후, 편집 균주(EcNΔLAFP)와 대조 균주(EcNWT)의 대사산물 생산을 비교함. 편집 균주는 대조 균주 대비 부티르산(butyrate) 생산이 최대 7배 이상 증가하고, 젖산(lactate)·에탄올(ethanol)·아세트산(acetate)·숙신산(succinate)의 생성은 감소하여 탄소 흐름이 효과적으로 재설계되었음을 확인함.
그림 2. RAMBE 시스템을 이용한 프로바이오틱스 대장균 EcN의 6개 유전자 동시 편집 및 아세트산 기반 생장 분석 [사진=한국생명공학연구원]가) RAMBE 시스템을 활용하여 대장균 EcN의 6개 유전자(ldhA, adhE, frdA, pta, cspC, patZ)에 조기 종결 코돈을 도입함으로써, 포도당 유래 부산물 생성 경로를 차단하고 아세트산 활용 경로를 강화하는 탄소 흐름 재설계 모식도.
나) 반복적인 RiboJ 리보자임, sgRNA 스캐폴드, 유전자 특이적 스페이서로 구성된 배열을 통해 6개의 유전자에 조기 종결 코돈을 도입하였으며, 일부 표적을 제외하고 대부분의 유전자에서 높은 편집 효율을 확인함.
다) 아세트산을 유일한 탄소원으로 제공한 M9 최소배지 조건에서, 편집 균주(EcNΔLAFPCP)는 기존에 아세트산 활용이 가능한 것으로 보고된 균주(DSM01ΔCP)와 유사한 수준의 안정적인 생장을 나타냄. 이를 통해 RAMBE 기반 편집 균주의 아세트산 대사 경로가 성공적으로 재설계되었음을 확인함.
그림 3. NR-RAMBE 시스템 개발을 위한 염기편집 활성 분석 및 구성요소 최적화 [사진=한국생명공학연구원]가) BE3와 RiboJ-sgRNA가 유도물질에 반응하는 프로모터에 의해 발현되며, 형광 단백질 리포터 유전자를 포함한 유전자 회로를 통해 염기편집 활성을 감지하는 시스템 모식도. 형광 단백질 유전자는 비활성화된 ACG 시작 코돈을 포함하고 있으며, 염기편집을 통해 ACG가 ATG로 변환될 경우 형광 단백질의 발현이 유도됨. 이를 통해 염기편집 활성은 형광 신호로 정량화됨.
나) 다양한 리보자임의 염기편집 활성을 비교 평가한 결과. 형광 단백질 발현율을 유세포 분석기를 통해 측정하였으며, 일부 리보자임은 기존 RiboJ와 유사하거나 더 높은 활성도를 보임.
다) sgRNA 스캐폴드 서열을 다양하게 변형하여 반복 서열을 줄이면서도 편집 효율이 유지되는 조합을 선별하기 위한 대규모 스크리닝 결과. 총 72종의 변형 sgRNA 스캐폴드 중 일부는 높은 형광 단백질 발현율을 보이며, 효율 저하 없이 반복 서열을 최소화할 수 있는 구성을 확인함.
그림 4. NR-RAMBE 시스템의 개발 및 반복 서열 비교 분석 [사진=한국생명공학연구원]가) 기존 RAMBE(R6)는 동일한 RiboJ-sgRNA 모듈을 반복 배열한 구조인 반면, NR-RAMBE(N6)는 서로 다른 리보자임과 변형된 sgRNA 스캐폴드를 조합하여 반복 서열 없이 설계된 비반복 배열임.
나) RAMBE(R6)와 NR-RAMBE(N6)를 각각 활용해 6개 유전자(ldhA, adhE, frdA, pta, cspC, patZ)를 동시에 편집한 결과, NR-RAMBE는 대부분의 표적에서 기존 RAMBE와 유사한 수준의 높은 편집 효율을 유지하였음. 이를 통해 반복 서열 없이도 정확한 sgRNA 처리 및 고효율 편집이 가능함을 확인함.
다) 반복 서열을 분석한 결과, RAMBE(R6)는 약 1,026bp의 직렬 반복(tandem repeat)과 918bp의 산재 반복(interspersed repeat) 등 총 1,944bp의 반복 서열을 포함하지만, NR-RAMBE(N6)는 이를 약 194bp로 줄여 DNA 합성의 안정성과 효율을 크게 향상시켰음.
본 기사는 네티즌에 의해 작성되었거나 기관에서 작성된 보도자료로, BRIC의 입장이 아님을 밝힙니다. 또한 내용 중 개인에게 중요하다고 생각되는 부분은 사실확인을 꼭 하시기 바랍니다.
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