연일 계속되는 무더위로 비브리오 패혈증에 대한 경각심이 높아지고 있는 가운데, 국내 연구진이 비브리오균이 패혈증을 촉진하는 병인을 새롭게 밝혀내었다.

한국생명공학연구원(원장 김장성) 마이크로바이옴융합연구센터 김명희 박사 연구팀은 비브리오 패혈증균이 체내 침투 후 인체 면역 방어 체계를 무력화하는 원리를 규명하는 데 성공하였다고 밝혔다.

이번 연구성과는 현재 항생제 외에는 치료제가 없는 패혈증균 등에 의한 감염병의 치료제 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 

지구 온난화와 이로 인한 해수 온도 상승으로 인해 비브리오 패혈증에 대한 위험도 높아지고 있다. 비브리오 패혈증은 비브리오 패혈증균에 오염된 어패류를 생식하거나 피부의 상처를 통해 침투한 균에 감염되었을 때 발생하는 급성 질환이다.

비브리오 패혈증은 해수 온도가 높아지는 5~6월경에 발생하기 시작해 8~9월에 가장 많이 발생한다. 지난해에도 69명의 비브리오 패혈증 환자가 발생하는 등 국내 발생 환자 수는 매년 100명 미만으로 많지는 않지만, 사망률이 40~50％를 넘는 매우 심각하고 위중한 질환이다.

비브리오 패혈증균이 생산하는 가장 치명적인 물질은 다양한 독성 인자들을 함유한 MARTX(Multifunctional autoprocessing repeats-in-toxin toxin) 독소이다.

MARTX 독소는 패혈증균이 인체에 감염되기 전에는 함유한 독성 인자들이 비활성화된 묶음 형태로 존재하지만, 감염 후 인체 세포에 침투하면 인체 세포 단백질을 이용해 독성 인자들을 방출시켜 세포 기능을 마비시키고 패혈증을 촉진한다. 

연구팀은 2019년 수행한 연구에서 어떻게 MARTX 독소에서 독성 인자들이 방출되어 병원성을 급격히 활성화하는지를 규명한 바 있다.

연구팀은 이번 연구에서 MARTX 독소에서 방출된 독성인자가 인체 세포 내 단백질과 만나 인체 면역을 공격하는 ‘트랜스포머 단백질’로 전환해 초기 방어시스템을 무너뜨리고 패혈증을 촉진한다는 사실을 밝혀내었다.

X-선 결정학과 초저온-전자현미경(cryo-EM) 기술을 활용해 비브리오 패혈증균의 독성인자와 인체 세포 단백질 간의 결합을 정밀하게 관찰한 결과, 

MARTX 독소가 방출한 여러 독성인자 중 유일한 듀엣 독성인자인 ‘DUF1-RID’는 인체 세포 신호전달에 중요한 기능을 담당하는 단백질 칼모듈린(calmodulin, CaM)과 강하게 결합해 인체 대사와 면역 유지에 필수적인 물질인 NAD+(nicotinamide adenine dinucleotide)를 분해하는 효소(NADase)로 바뀌고, 동시에 또 다른 세포 신호전달 단백질인 Rac1(Rho family small GTPase)과도 결합하여 감염 초기의 면역 방어에 핵심 물질인 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 생산을 마비시켰다.

연구팀은 이를 바탕으로 DUF1-RID이 CaM, Rac1과 결합하지 못하도록 돌연변이 패혈증균을 제작하고 이를 동물모델에 적용하자 별다른 증상 없이 생존하는 것을 확인하며 패혈증 치료의 새로운 대안 가능성을 제시하였다. 연구책임자인 김명희 박사는 “그동안 몰랐던 비브리오 패혈증균의 트랜스포머 단백질의 기능을 입체구조 규명으로 알 수 있었고 나아가 비브리오 패혈증균 감염이 기저 질환자들에게 치명적인 이유를 알게 되었다.”라며, “트랜스포머 단백질은 비브리오 패혈증균 외에도 콜레라균 등 다른 병원균에서도 발견되는 것으로, 본 연구에서 확보한 고해상도 입체구조는 패혈증을 유발하는 감염병 치료제 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대한다.”라고 밝혔다.

이번 연구는 7월 23일 저명한 국제학술지인 Nature Communications (IF 14.7) 온라인판에 게재되었으며,(논문명 : Dissemination of pathogenic bacteria is reinforced by a MARTX toxin effector duet / 교신저자 : 김명희‧황중원 박사 / 제1저자 : 최상현 박사과정 대학원생, 이영진 박사) 과학기술정보통신부 바이오·의료기술개발사업과 한국생명공학연구원 주요사업의 지원으로 수행되었다.

연  구  결  과  개  요

□ 연구배경

○ 비브리오 패혈증균은 주로 해안지역에서 6~9월에 흔히 발생하는 세균으로 균이 오염된 어패류를 생식하였거나, 균에 오염된 해수에 피부 상처가 노출된 경우 감염될 수 있다.

○ 특히 간 질환 환자, 알코올 중독자, 당뇨병, 만성신부전증 등 만성질환자들에게 감염 시 평균 1~2일의 잠복기를 거쳐 패혈증을 유발하고 사망률 50~70% 일으키는 급성 감염 질환 원인균으로 국내에서는 매년 50~100명의 환자가 보고되고 있고 2023년도에 27명의 사망자가 발생하였다. 

○ 특히 기후 변화로 인한 해수 온도가 상승하고 있음에 따라 비브리오 패혈증균의 발생 시기도 앞당겨지고 균의 성장 속도도 빨라져 환자 수가 늘고 있는 세계적으로 문제시되는 감염균이다. 

○ 비브리오 패혈증균이 생산하는 가장 치명적인 물질은 MARTX 독소로 독소 내에는 다양한 독성 인자들이 묶음 형태로 존재하고 있고 각 단위의 독성 인자들로 가공되어서 방출된 후 인체 세포 단백질들을 공격해서 세포 기능을 마비시키고 균의 증식을 통해 패혈증을 일으킨다. MARTX 독소는 패혈증균 외에도 콜레라균 등을 포함한 매우 다양한 병원균이 분비한다. 

□ 연구내용

○ 연구팀은 환자에서 분리한 비브리오 패혈증균들이 인체에 감염된 후, 다양한 독성 인자들이 비활성화 형태로 묶여 있는 독소(MARTX toxin)를 인체 세포에 주입하고, 어떤 기작에 의해 독성 인자들을 독소로부터 방출시켜 활성화를 통해 병원성을 급격히 증진하는지에 대한 기전을 규명한 바 있다(PNAS 2019년).

○ 연구팀은 이러한 독성인자 방출 과정에서 DUF1과 RID라고 불리는 2종의 독성 인자들이 듀엣 형태로 방출되는 현상을 발견하였고, 본 연구에서 인체 타겟이 무엇인지 분석을 통해 듀엣 독성인자(DUF1/RID)는 독소로부터 방출 후 즉각적으로 인체 세포의 중요 단백질들인 CaM 그리고 Rac1과 강하게 결합하는 것을 확인하였다. 

○ X-선 결정학과 cryo-EM 기술로 듀엣 독성인자(DUF1/RID)와 CaM/Rac1의 복합체 입체구조를 분석한 결과, 듀엣 독성인자는 인체 단백질들과 결합 후 인체의 물질대사와 면역 유지에 필수 물질인 NAD+를 빠르게 가수분해하여 무력화시키는 NADase라는 효소로 전환하고, 이와 동시에 Rac1의 기능도 무력화시키는 트랜스포머 단백질임을 확인하였다.

○ 감염 환자에서 분리한 비브리오 패혈증균의 엔지니어링으로, 정상적인 트랜스포머 단백질을 발현하여 인체 타겟 단백질들과 합체를 할 수 있는 패혈증균과 합체 기능을 잃은 돌연변이 패혈증균을 제작하였고, 면역세포인 대식세포에 감염시켜 NAD+ 수준과 ROS의 양을 측정한 결과, 합체 기능을 잃은 돌연변이 패혈증균이 감염된 대식세포의 NAD+와 ROS 수준은 정상인 반면, 정상적인 트랜스포머 단백질을 발현하는 패혈증균이 감염된 대식세포는 NAD+ 수준이 상당히 낮아져 ROS 생산량이 급격히 감소하는 것을 확인하였다.

○ 또한, 생쥐에 감염시켜 분석한 결과, 트랜스포머 단백질이 정상적으로 발현되는 패혈증균이 감염된 생쥐들은 NAD+의 가수분해로 생체 수준이 급격히 낮아지고 Rac1의 기능이 상실되어, 초기 면역 방어 실패로 인해 혈액 비장, 간 등에서 패혈증균의 증식이 일어나고, 이에 따른 과잉 염증반응에 따른 사이토카인 폭풍 증후와 함께 패혈증으로 생존율이 급격하게 낮아지는 반면, 트랜스포머 단백질의 기능을 하지 못하는 돌연변이 패혈증균이 감염된 생쥐들은 별 증세 없이 생존하는 것을 확인하여 트랜스포머 단백질의 패혈증 가속화 기능을 입증하였다.

○ 결론적으로, 비브리오 패혈증균에게도 생존을 위한 필수 물질인 NAD+를 훼손하지 않기 위해 패혈증균 내에서는 트랜스포머 단백질을 비활성화 상태로 유지하고, 감염 후에 인체 단백질들을 적극 활용하여 NAD+를 가수분해하는 효소로 변신함과 동시에 Rac1도 함께 무력화하는 병원성균의 감염 활성화에 대한 전략 발견은, 끊임없이 인간과 싸움을 통해 생존하려는 병원성 미생물의 정교한 진화를 보여주는 중요한 예시로, 새로운 관점으로 감염을 이해하는 데 기여하고, 이를 활용한 다양한 병원균의 감염병 치료제 개발의 가능성을 제시하고 있다.

□ 연구성과의 의미

○ 병원성 세균의 정교한 진화를 통한 인체 감염의 새로운 전략 발견  

- 비브리오 패혈증균뿐만 아니라 콜레라균 등 다양한 병원성 세균은 MARTX 독소를 활용하여 감염 후 숙주 세포에 독성 인자들을 전달한다. 그동안 독성인자 중에서 DUF1의 기능은 무엇인지 및 왜 RID와 듀엣으로 전달이 되는지 알지 못했다. 비브리오 패혈증균에게도 필수 물질인 NAD+를 훼손하지 않기 위해 감염 후 트랜스포머 단백질이 인체 단백질들을 활용하여 합체를 통한 인체에 필수 물질인 NAD+를 공략하는 전략은, 끊임없이 정교하게 진화하는 병원성 미생물의 또 다른 중요한 예시로, 새로운 관점에서 감염을 이해하여 치료제 개발에 활용이 가능할 것으로 기대한다. 

그림1. 인체 세포 내 단백질 칼모듈린(CaM)과 결합해 면역체계 필수 물질을 분해하는 효소(NADase)로 전환하는 비브리오 패혈증균 트랜스포머 단백질(DUF1/RID) [사진=한국생명공학연구원]
  A. 트랜스포머 단백질[DUF1과 RID의 아미노-말단 도메인(RIDCBD)]의 입체구조
  B. 인체 CaM과 결합하여 NAD+를 가수분해하는 효소(NADase)로 전환한 트랜스포머 단백질
  C. 인간 유래 NADase 효소인 CD38과 유사하게 생긴 변형 후의 DUF1. NADase 효소 활성에 필요한 아미노산 잔기들이 표시됨
  D. 트랜스포머 단백질의 CaM-의존적 NADase 활성 기능DUF1E/Q-RIDC/A, NADase 활성에 필수적인 아미노산 E2186이 glutamine으로 돌연변이된 트랜스포머 단백질 DUF14mt-RIDC/A, CaM과 결합하지 못하는 트랜스포머 단백질

그림2. 비브리오 패혈증균의 트랜스포머 단백질(DUF1/RID)과 인체 단백질들(CaM/Rac1)이 결합한 복합체의 cryo-EM 입체구조 [사진=한국생명공학연구원]
  A. 트랜스포머 단백질(DUF1/RID)-인체 단백질(CaM/Rac1) 복합의 입체구조
  B. NADase의 효소 활성에 중요한 DUF1의 아미노산 E2186과 Rac1의 poly basic region(PBR)을 변형(Nε-fatty acylation)하여 기능을 무력화시키는데 중요한 RID의 아미노산 C2838이 표시됨
  C. (위)비브리오 패혈증균이 인체 세포로 MARTX 독소를 주입 후, 독소로부터 방출된 트랜스포머 단백질이 세포막으로 이동(아래) CaM과 결합해 NADase로 변형하여 NAD+를 무력화시키고 동시에 Rac1과도 결합하여 변형(Nε-fatty acylation)을 통해 무력화

그림3. 비브리오 패혈증균의 트랜스포머 단백질에 의한 패혈증 활성화 [사진=한국생명공학연구원]
 A. 비브리오 패혈증균에 감염된 생쥐로부터 분리한 말초혈액 단핵세포의 NAD+ 수준
 B~D. 비브리오 패혈증균에 감염된 생쥐의 혈액, 비장 및 간에서의 패혈증균 수
 E~G. 패혈증균 감염 시간에 따른 생쥐의 과잉 염증반응에 의한 사이토카인 폭풍 증후
 H. 비브리오 패혈증균에 감염된 생쥐의 생존율
     - (EF::DUF1-RID)정상 트랜스포머 단백질을 발현하는 비브리오 패혈증균
     - (EF::DUF1-RIDC/A)CaM와 결합으로 NADase 활성은 있지만 Rac1을 변형시키는 활성을 잃은 패혈증균
     - (EF::DUF1E/Q-RIDC/A)NADase 활성과 Rac1을 변형시키는 활성을 잃은 패혈증균
     - (EF::DUF1mt-RIDC/A)CaM과 결합할 수 없어 NADase 활성과 Rac1을 변형시키는 활성을 잃은 패혈증균