- 인간 전분화능 줄기세포 유래 장(腸) 오가노이드에서 장 줄기세포를 대량으로 배양하는 기술 개발…내강 접근 용이한 스테레오 타입의 장 상피세포 분화기술도 개발
- 임상 등급의 고순도 줄기세포를 대량 배양 가능해 재생치료제 개발 등에 활용 기대

재생치료 등에서 수요가 높은 고순도의 줄기세포를 대량으로 만들 수 있는 기술이 국내 연구진에 의해 개발되었다. 한국생명공학연구원(원장 김장성, 이하 생명연)은 줄기세포융합연구센터 손미영 박사팀이 세계최초로 인간 장(腸) 오가노이드에서 장 줄기세포를 농축 배양할 수 있는 기술을 개발하는 데 성공했다고 밝혔다.

이는 인간 장 줄기세포를 대량 배양 및 동결 보관할 수 있는 기술로 향후 재생치료제 개발 및 다른 신약 개발 기초연구에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있다. 오가노이드는 줄기세포나 조직공학 기술을 활용해 제작한 인체 장기유사체로 매우 높은 수준으로 인체 장기를 모사할 수 있어 동물 대체실험이나 신약 개발, 재생치료 등에서 활발히 활용되고 있다. 

줄기세포는 신체를 구성하는 세포로 분화하는 능력이 있어 재생, 인공장기 형성, 세포 치료 등에서 이용이 기대되고 있다. 하지만 생체 내에서 한정된 양으로만 존재할 뿐만 아니라 배양이 어려워 채취하면 안정적인 보관이 필수적이지만, 장기간 보관을 위한 환경 유지가 쉽지 않아 안전하고 효율적으로 줄기세포를 얻을 수 있는 기술 개발에 대한 수요가 높다.

이에 연구팀은 인간 전분화능 줄기세포를 이용해 만든 3차원 장 오가노이드에서 고순도의 인간 장 줄기세포 집합체를 대량 배양할 수 있는 기술을 개발하였다. 단일 세포 전사체 분석을 통해 장 줄기세포 집합체들이 고농축 되어 있음을 확인하고 이를 분리‧배양하는데 성공하며, 화학적 조성이 명확한 배지 환경에서 인간 장 줄기세포를 배양할 수 있게 된 것이다.

특히, 연구팀은 생산된 장 줄기세포 집합체가 마우스 동물모델의 손상된 장 상피 세포 조직을 재생시키는 것을 확인하며 치료제로서의 이용 가능성을 높였으며, 동시에 향후 재생치료제로 개발 가능한 임상 등급의 인간 장 줄기세포를 대량 생산할 수 있는 기반 기술을 확보하였다. 나아가 연구팀은 세포를 공기 중에 노출해 분화를 유도하는 기체-액체 계면(Air-Liquid Interface) 분화법을 이용해 2차원 장 줄기세포를 입체적 구조를 가진 장 상피 세포로 분화하는 기술도 개발하였다.

장 오가노이드는 내부가 비어있는 내강(內腔, lumen)을 중심으로 상피 세포와 세포 외 기질이 둘러싸고 있는 둥근 공 형태인데, 장 상피 세포가 내부의 내강에 접근하기가 어려워 다양한 응용 연구에 활용하기 어렵다는 한계가 있었다. 연구팀이 개발한 스테레오 타입의 2.5차원 장 상피 세포 모델 시스템은 실제 인간의 소장을 모사할 수 있으며, 내강 접근도 용이해 다양한 질환 모델 제작과 신약 개발을 위한 플랫폼 기술로 활용할 수 있다.

이번 연구를 주도한 손미영 박사는 “재생치료제의 핵심 성분인 인간 장 줄기세포는 분리 배양이 어려워 동물 실험 의존도가 높았는데 전 세계에서 유일하게 대량, 장기배양이 가능한 인간 정상 장 줄기세포 모델을 이용해 다양한 기초 연구가 활성화되길 기대한다.”라며, 

“이번 성과를 본 연구팀이 이미 확보한 다양한 장 오가노이드 배양기술과 접목하여 기초연구 수준을 넘어 기술의 실용화를 위해 더욱 활발한 연구 활동을 이어 나가겠다.”라고 의지를 밝혔다.

한편 이번 연구는 1월 27일 종합과학 분야의 세계적인 과학저널인 Nature Communications(IF 17.694) 온라인 판에 게재되었으며,
(논문명 : Chemically-defined and scalable culture system for intestinal stem cells derived from human intestinal organoids / 교신저자 : 손미영 박사 / 제1저자 : 권오만 박사)

과기정통부 Korea Bio Grand Challenge 사업, 산업부 바이오산업핵심기술개발사업, 범부처 재생의료기술개발사업, 식약처 첨단독성 평가기술 기반구축사업, 그리고 생명연 주요사업의 지원으로 수행되었다.

연  구  결  과  개  요

□ 연구배경

○ 인간 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장 오가노이드는 높은 수준으로 인체를 모사할 수 있는 우수한 모델 시스템이지만 분화 배양에 시간과 노력이 많이 소요되며, 대량 배양과 동결보관이 어렵고, 마트리젤 내부에서 자라기 때문에 내강에 접근하기 어렵다는 한계점이 있었다.

○ 따라서, 쉽고 빠른 계대 배양을 통한 장 오가노이드의 장기 배양 및 대량 배양, 동결보관을 통한 안정적인 오가노이드 유지, 내강에 접근이 쉬운 배양법 개발을 통한 새로운 장 오가노이드 배양기술 개발이 지속적으로 요구되어져 왔다.

 ○ 이러한 한계점을 극복하기 위해 장 줄기세포를 분리 배양하는 기술을 개발하고자 하였고, 장 줄기세포의 분리 배양이 가능할 시 쉽고 빠르게 계대 배양이 가능하며, 대량 배양과 동결보관이 쉬우며, 나아가 내강의 접근이 용이해 다양한 응용 연구와 접목을 할 수 있다는 장점이 있다.

 ○ 실제로, 인간의 장 조직으로부터 장 줄기세포만을 분리하여 기저세포(feeder cell) 위에서 배양하는 기술이 2015년 Nature 지에 보고된 바 있으며, 기체-액체 계면 분화법을 이용하여 장 상피세포로 분화도 시킬 수 있음을 보여주었다. 

 ○ 따라서, 장 오가노이드에서 장 줄기세포만을 분리하여 농축 배양할 수 있으며, 필요 시 기체-액체 계면 분화법을 이용하여 장 상피세포로 분화시킬 수 있을 것으로 예상하였으며, 본 기술 개발 시 재생치료를 위한 세포치료제 개발 및 질환 모델링, 스크리닝 플랫폼 개발을 통한 신약 개발 연구 등 다양한 응용 연구와 접목을 할 수 있을 것으로 기대되었다.

□ 연구내용

 ○ 본 연구팀은 전분화능 줄기세포 유래 3차원 장 오가노이드로부터 세계최초로 장 줄기세포 집합체 농축 배양법을 구축하였으며, 장 줄기세포 배양에 필수적인 인자들을 모두 규명하여 화학적 조성이 명확한 배양법 개발에 성공하였다. 

 ○ 단일세포 전사체(single cell RNA sequencing; scRNA-seq) 분석 결과 장 줄기세포 집합체의 90% 이상이 줄기세포 또는 전구체 세포의 마커를 발현하고 있는 것으로 확인되었으며, 장 상피를 구성하는 분화세포들의 마커는 거의 발현되지 않는 것을 확인함으로써 장 줄기세포 집합체들이 농축되어 있음을 확인하였다. 

 ○ 또한, 기체-액체 계면 분화법을 이용하여 장 상피세포로 분화가 가능하며, 장 상피세포로 분화 시 장 상피의 융모와 유사한 구조가 형성되고, 마커 유전자의 발현이 증가하며, 장 상피의 두께 및 TEER 값이 증가하는 것을 확인하였다.

 ○ 이러한 장 줄기세포 집합체 배양기술은 유전자편집 기술과의 접목을 통해 리포터 세포 주 제작이 가능하며, 마우스 모델을 이용하여 재생치료를 위한 세포 치료제로 개발할 수 있다는 것을 보여주었다. 또한, 장 상피세포를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스 감염 모델 시스템을 구축하여 숙주-바이러스 연구에 활용이 가능한 것을 보여줄 수 있었다.

 ○ 이러한 결과들을 기반으로 장 줄기세포 집합체 및 장 상피세포 모델은 다양한 생물학적 실험에 광범위하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

□ 연구성과의 의미

 ○ 장 줄기세포 집합체 농축 배양 기술 : 고순도 세포 대량 생산 및 재생 치료를 위한 세포치료제 개발 가능

  - 본 연구에서 개발한 고순도 장 줄기세포 집합체 배양 시스템은 세계최초로 인간 장 줄기세포를 분리·배양할 수 있는 기술로써 생명과학, 의학, 제약 등 다양한 분야에서 연구 및 상업적으로 이용 가능하다. 특히, 장 줄기세포 및 전구체 세포를 쉽고 빠르게 유전적 변이 없이 안정적으로 대량 배양 및 동결보관이 가능하다. 

  - 화학적 조성이 명확한 배지를 통해 배양되는 장 줄기세포 집합체는 장 상피가 손상된 환자들의 재생치료를 위한 세포 치료제로 활용될 수 있으며, 향후 환자 유래 역분화 줄기세포를 이용하여 환자 맞춤형 세포 치료제를 제작할 수도 있어, 향후 임상 등급의 인간 장 줄기세포 생산이 가능하게 하는 플랫폼 기술로 가치를 갖는다.

 ○ 장 상피세포 기반 신약개발 플랫폼 제시 : 스테레오 타입의 2.5차원 장 상피 모델을 활용한 질환 모델링 및 신약 스크리닝 가능

  - 본 연구에서 개발한 2.5차원 장 상피 세포 모델 시스템은 입체적 구조를 가져 실제 인간의 소장을 모사할 수 있으며, 내강 접근이 용이하므로 다양한 질환 모델링 및 신약 개발을 위한 플랫폼 기술로 활용이 가능하다. 

  - 또한, 본 연구팀에서 제시한 2.5차원 상피 세포 모델은 환자 맞춤형 모델로 개발 가능하므로, 개인에 따라 최적의 약물 요법을 선택할 수 있는 평가 플랫폼으로 이용될 수 있다.

연  구  결  과  문  답

이번 성과 뭐가 다른가

3차원 장 오가노이드는 대량 균질 배양이 어렵고, 동결보관을 통한 장기 보관이 어렵습니다. 뿐만 아니라, 내강에 접근하기가 어렵다는 단점이 있습니다. 본 연구는 2차원 장 줄기세포 배양을 통해 대량 배양 및 동결보관이 가능하고, 내강에 용이한 장 상피세포 모델을 구축할 수 있음에 의의가 있습니다.

어디에 쓸 수 있나

장 줄기세포 집합체의 경우 재생치료를 위한 세포 치료제로 활용이 가능하며, 리포터 세포 주 제작 등을 통한 기초연구에도 활용이 가능합니다. 2.5차원 장 상피세포의 경우 다양한 질환 모델링과 더불어 약물의 흡수 및 독성 평가 등 다양한 응용 연구에 활용이 가능합니다. 

실용화까지 필요한 시간은

본 기술은 장 줄기세포 농축 배양이 가능할 뿐만 아니라 화학적 조성이 명확한 환경에서 배양이 가능함에 따라 실제 임상 등급의 세포 생산이 가능할 것으로 보입니다. 특히, 후속 연구를 통해 실용화를 위한 배양 접시 및 배양 배지 개발 등의 연구를 동시에 수행하고 있어 멀지 않은 시일 내에 실용화 하는 것을 목표로 하고 있습니다. 하지만, 실제 치료제 개발에는 많은 시간과 노력이 필요하므로 속단하지는 않고 있습니다.

실용화를 위한 과제는

실용화를 위한 과장 큰 과제는 임상 등급의 세포를 안정적으로 생산하기 위한 생산 기술 개발 및 효능 검증이 추가적으로 더 필요합니다. 세포치료제로 실질적으로 활용하기 위해서는 충분한 세포의 수를 확보해야 하고, 대량 생산을 통해 생산된 세포 또한 임상 시험에서 충분한 효능을 보여주어야 합니다. 앞으로 대량 생산과 효능 검증에 추가적인 노력이 더 필요할 것으로 보입니다.

연구를 시작한 계기는

3차원 오가노이드 배양을 경험하면서 배양법이 어렵고, 활용도를 높이기 위한 개선이 필요하다고 생각하게 되었습니다. 당시 다양한 전략을 통해 배양법을 개선하고자 노력하였고, 덕분에 본 논문을 포함하여 몇 편의 논문을 발표할 수 있었습니다.

에피소드가 있다면

처음 본 연구의 필요성을 느끼고 난 후 한동안 배양 기술 개선을 위한 개선 전략 디자인에 어려움을 겪고 있었습니다. 운이 좋게도 당시 해외 학회에 참석할 수 있는 기회를 얻게 되었고, 학회장에 전시된 포스터에서 우리 시스템에 적용하기 좋은 기술에 대한 아이디어를 얻게 되었습니다. 학회를 마친 후 귀국하여 얼른 새로운 아이디어를 실험으로 옮겨 보았고, 놀랍게도 본 논문의 핵심 데이터 중 가장 초기 결과를 얻을 수 있었습니다.  

꼭 이루고 싶은 목표는

본 연구 논문은 플랫폼 기술 개발에 해당하는 내용입니다. 앞으로 새롭게 구축한 플랫폼 기술을 이용하여 많은 연구자에게 좋은 시스템을 제공하고 싶고, 함께 공동연구를 진행하고 싶습니다. 뿐만 아니라, 플랫폼 기술 개발에 멈추지 않고, 더 나아가 기초연구 및 실용화 연구 등 지금보다 더 폭넓고 깊이 있는 연구를 수행하고 싶습니다. 

신진연구자를 위한 한마디

현대 과학의 발전 속도가 놀랍도록 빠른 것 같습니다. 신기술이 쏟아져 나오고, 따라가기 힘들 정도로 많은 데이터와 양질의 논문이 계속 생산되어 나오고 있습니다. 개인 차원에서 이러한 빅데이터를 모두 찾아내고 처리하기란 불가능에 가까운 것 같습니다. 결국은 본인의 전문 분야에 선택과 집중을 해야하고, 다른 전문성을 가진 연구자와 토론하고 협업하는 것이 중요하다고 생각합니다. 본인의 연구에 집중하는 것과 동시에 주변의 좋은 동료들과 열린 마음으로 토론하고 협업할 수 있도록 미리 준비하는 것이 좋다고 생각합니다.

그림1. 3차원 장 오가노이드 유래 2차원 장 줄기세포 농축 배양 기술 모식도 [사진=한국생명공학연구원]

그림2. 3차원 장 오가노이드 유래 2차원 장 줄기세포 집합체 배양 기술 개발 [사진=한국생명공학연구원]
(A-E) 2차원 장 줄기세포 집합체 배양 기술 및 화학적 조성이 명확한 배양 배지 개발을 통해 장 줄기세포를 안정적으로 장기배양 및 동결보관이 가능한 것을 확인함 

그림3. 장 줄기세포 집합체의 단일 세포 전사체 분석 결과 [사진=한국생명공학연구원]
(A-E) 단일세포 전사체 분석을 통해 장 줄기세포 집합체가 고순도의 장 줄기세포와 전구체 세포로 구성된 것을 확인하였고, 면역형광염색법을 이용해 이를 검증함

그림 4. 기체-액체 계면 분화법을 이용한 입체적 구조를 가진 2.5차원의 장 상피세포 분화 기술 모식도 [사진=한국생명공학연구원]

그림 5. 2차원 장 상피 세포 분화 기술 개발 및 특성 분석 [사진=한국생명공학연구원]
(A-F) 스테레오 타입의 2.5차원 장 상피세포 분화 시 날짜에 따른 세포 형태 분석 및 TEER 값 측정, H&E 및 면역형광염색을 통한 단면 분석, 전사체를 기반 PCA 분석과 증가 또는 감소하는 유전자 클러스터 분석 결과를 통한 장 상피세포의 특성을 확인함

그림 6. 장 줄기세포 집합체의 재생치료제 효능 검증 [사진=한국생명공학연구원]
(A-E) 마우스 질환 모델 기반 장 손상 후 장 줄기세포 집합체 이식에 따른 마우스 몸무게 변화 양상 분석, 장 상피 재생 효과 내시경 분석, 형광 및 인간 특이적 발현 단백질 면역형광염색을 이용한 장 줄기세포 생착 확인을 통해 장 줄기세포 집합체의 재생치료제 효능을 검증하였음