- 합성 미생물 생태계를 구성하는 미생물 간 역할을 조절하는 기술 개발
- 바이오에너지 및 고부가 화합물 생산 등 산업적으로 활용 가능한 고효율 합성 미생물 생태계 구축 기대

한국생명공학연구원이 미국 일리노이 대학과의 공동연구로 합성생물학 생태계를 이용해 보다 효율적으로 바이오 연료를 생산할 수 있는 기술을 개발하였다.

한국생명공학연구원(원장 김장성, 이하 생명연)은 합성생물학연구센터 신종혁 박사가 일리노이 대학교 어바나-샴페인 캠퍼스(University of Illinois Urbana-Champaign, 이하 UIUC) 진용수, Ting Lu 교수팀과 공동으로 미생물 생태계에서 효모 균주 간 역할 분담을 최적화하는 기술을 개발하는 데 성공했다고 밝혔다.

자연계의 미생물은 홀로 존재하지 않고, 군집을 이뤄 생태계를 구축해 살아가며, 그 안에서 역할 분담(Division of labor, DOL)과 상호작용을 하며 단독으로 있을 때 보다 우수한 기능을 발휘한다. 

이를 통해 극한 환경에서 살아남기도 하고, 단일 균주가 소비하기 어려운 탄소원을 소비하며 산업적 이용가치를 높여주기도 한다. 

최근 기후변화에 대한 우려로 바이오매스에서 친환경 바이오 연료를 생산하는 생물 발효와 바이오 화합물을 생산하는 세포공장 등의 바이오에너지 기술에 대한 관심이 높다.

미생물을 산업적으로 활용하기 위한 합성 미생물 생태계를 구축하기 위해서는 자연계 미생물 생태계 모사 전략이 중요하지만, 합성 미생물 생태계 내의 미생물 간 역할을 분담하고 상호작용을 할 수 있게 하는 체계적인 설계 방법이 아직 개발되지 않아 한계가 있었다.

이에 연구팀은 합성 미생물 생태계 내의 균주 간 역할 분담을 최적화하여 원하는 기능을 수행할 수 있는 합성 미생물 생태계 플랫폼을 개발하였다. 

연구팀은 나무와 같은 목질계 바이오매스에 풍부하게 존재하는 글루코스와 자일로스를 각각 소비하는 전문 균주 9종을 제작하고, 이를 혼합하여 미생물 생태계를 구축하였다.

그리고 구성 균주의 시작 농도를 바꿔 특정 당의 소비 속도를 세밀하게 조절할 수 있고, 구성 균주의 접종 시간을 조절해 에탄올로 인해 저해 받는 자일로스 발효의 효율을 최적화할 수 있는 플랫폼을 구축하였다.

나아가 효모 균주들이 서로 역할을 분담하여 복합당을 보다 효율적으로 발효하는 모델도 개발하였다. 

연구팀은 자일로스가 먼저 발효되도록 바이오매스 발효 프로세스를 개선해 바이오 연료 생산량을 약 2배 이상 증가시켰다.

교신저자인 UIUC 진용수 교수는 “이제 바이오연료 및 유용물질 생산을 위한 합성생물학 기술이 단일 미생물 균주의 개량을 넘어 상보적인 대사기능을 수행하는 다수의 미생물을 동시에 개량함으로써 생물 전환 공정의 효율을 높이는 단계로 발전할 것”이라고 전망했다.

제1저자인 생명연 신종혁 박사는 “기존의 미생물 생태계는 균주 간 역할 분담 조절의 어려움으로 인하여 산업적으로 응용되기 어려웠다.”라며, 

“이번 연구는 미생물 생태계의 산업적 적용 가능성을 제시하였고, 더 나아가 합성 미생물 생태계를 이용해 바이오매스로부터 단일 균주로는 생산이 어려운 고부가 화합물을 생산하는 혁신 플랫폼이 될 것이다.”라고 말했다.

한편 이번 연구는 1월 26일 세계적인 과학저널인 Nature Communications(IF 17.694) 온라인 판에 게재되었으며, (논문명 : Compositional and Temporal Division of Labor Modulates Mixed Sugar Fermentation by an Engineered Yeast Consortium / 교신저자 : Yong-Su Jin, Ting Lu / 제1저자 : 신종혁 박사, Siqi Liao) 미국 에너지부(US　Department of Energy)와 생명연 주요사업의 지원으로 수행되었다. 

□ 연구배경

 ○ 최근 기후변화에 대한 우려로 바이오매스로부터 생물연료 및 바이오 화합물을 생산하는 생물 발효에 관한 관심이 가속화되었습니다. 따라서, 연구자들은 산업 미생물을 더 다양한 기질의 사용, 발효 속도의 향상, 생산 화합물의 확대 등의 방향으로 개선하고 있습니다. 그러나 단일 균주 기반의 발효 시스템은 미생물 균주의 과도한 유전적 변형으로 인한 대사 부담과 세포 독성을 일으킨다는 한계점이 있습니다. 

 ○ 산업적으로 사용되는 미생물과 달리, 자연에서의 미생물은 일반적으로 공동체를 형성하여 살아갑니다. 이른바 미생물 생태계 내에서 미생물들은 더 우수한 기능을 가집니다. 예를 들어, 대사 과정을 구성 균주 간에 나누어 소비하기 어려운 기질을 더 효율적으로 활용하고, 가혹한 환경에서 생존 가능성을 높입니다. 미생물 생태계는 구성 균주들의 역할 분담(Division of labor, DOL)을 통해 단일 균주에 비해 많은 이점을 가지고 있습니다. 한 예로, 효모와 유산균은 자연에서 상호 공생을 이루면서 살아갑니다. 유산균은 내부 효소를 통해, 효모가 섭취하지 못하는 락토오스를 효모가 소비할 수 있는 글루코스, 갈락토스로 분해해 줍니다. 반대로 효모는 유산균이 만들지 못하는 필수 아미노산들을 만들어 분비해 줌으로써 두 균주는 더 다양한 기질 환경에서 살아갈 수 있게 됩니다. 

 ○ 미생물 생태계 기반 전략을 산업적으로 이용하기 위해 많은 연구가 진행되었지만, 산업적으로 사용하기에는 조절이 어렵다는 문제가 있습니다. 미생물 생태계를 조절하는 핵심은 미생물 내 생태계의 DOL을 정확하게 조절하여 분배하는 것입니다. 본 연구에서, 우리는 초기 생태계 구성 균주의 세포 농도와 접종 시기를 정량적으로 바꾸어, 미생물 공동체의 활성을 최적화할 수 있는 전략을 보여줬습니다. 미생물 공동체 DOL 분배를 정량적으로 분배하기 위해, 실제 발효 데이터를 기반으로 수학적 모델링을 수립했습니다. 수립된 수학적 모델링은 그로부터 설계된 모델 미생물 생태계의 활성을 크게 개선함을 확인했습니다. 

□ 연구내용

 ○ 본 연구진은 미생물 생태계 내 구성 균주의 DOL을 측정하기 위해서, 글루코스와 자일로스의 혼합당 발효 모델을 도입했습니다. 기존의 연구에서는 목질계 바이오매스에 풍부하게 존재하는 글루코스와 자일로스를 자일로스 대사 경로가 도입된 효모를 이용한 발효를 통해 바이오 에탄올로 전환해 왔습니다. 하지만, 효모 내 글루코스는 자일로스의 소비를 억제하는 대사 작용으로 인해 글루코스-자일로스의 순차적 소비가 일어나 복합당의 발효 효율을 감소시킵니다. 

 ○ 연구진들은 글루코스, 자일로스 소비의 두 가지 일을 한 균주에서 두 균주로 나누어 진행함으로써 DOL을 통한 시너지 효과를 보고자 했습니다. 연구진은 시스템 대사 공학 방법으로 글루코스와 자일로스 각각의 당만을 선택적으로 소비할 수 있는 글루코스 전문 효모(Glucose specialist)와 자일로스 전문 효모(Xylose specialist)를 제작했습니다. 연구진은 서로 다른 당 소비 속도를 가진 글루코스 전문 균주 5종 자일로스 전문 균주 4종을 제작했습니다. 

 ○ 연구진은 단일 균주와는 다르게 글루코스 전문 균주, 자일로스 전문 균주로 구성된 미생물 생태계는 구성 균주의 시작 농도를 바꿈으로써, 특정 당의 소비 속도를 세밀하게 조절할 수 있음을 확인했습니다. 또한 미생물 생태계 구성 균주의 접종 시간을 조절해 줌으로써, 에탄올에 의해 저해 받는 자일로스 발효의 효율을 최적화할 수 있다는 사실도 규명했습니다. 

 ○ 연구진은 미생물 생태계의 구성 균주 농도와 접종 시간을 정량적으로 디자인하기 위해, 실험을 통해 얻은 결과를 바탕으로 수학적 모델을 구축했습니다. 균주의 비율, 접종 시간이 바뀌었을 때의 소비되는 글루코스, 자일로스의 농도, 생산되는 에탄올 생산 등의 실험 결과를 토대로 상미분방정식을 이용한 모델을 구축했습니다. 

 ○ 구축된 수학적 모델은 임의의 글루코스, 자일로스 농도를 가지는 복합당의 발효 실험에서 균주의 구성 비율, 접종 시간을 최적화할 수 있음을 확인했습니다. 나아가, 실제 전처리를 통해 얻은 목질계 바이오매스의 산업적 발효에 구축된 미생물 생태계가 사용될 수 있음을 증명했습니다. 

□ 연구성과의 의미

 ○ 다양한 복합당 비율을 가지는 목질계 바이오매스의 고효율 발효 방법 제시 

  - 목질계 바이오매스는 전처리 방법에 따라, 다양한 복합당 비율을 가집니다. 따라서 단일 균주 발효의 경우, 달라진 복합당 비율에 맞춰서 복잡한 시스템 대사 공학에 기반한 균주 최적화가 필요합니다. 반면, 미생물 생태계는 간단히 균주의 비율과 접종 시간을 바꿈으로써 균주 최적화가 가능합니다. 덧붙여, 수학적 모델링을 통해 당 농도에 따른 미생물 생태계의 더 정량적인 최적화가 가능함을 제시하였습니다. 

  - 기존에 효율적인 복합당 소비를 위해서는 단일 균주 내 글루코스와 자일로스의 동시 소비가 최적의 방법일 것이라 여겨져 왔습니다. 글루코스와 자일로스의 동시 소비를 위해서, 방향적 진화, 새로운 당 수송 효소의 발견, 대사 공학 등 다양한 시도가 이어져 왔지만, 효율적인 복합당 소비는 사실상 성공하지 못했습니다. 본 연구에서는 복합당의 동시 소비라는 선입견을 넘어, 미생물 생태계를 이용해 복합당 내 생산된 에탄올의 저해를 최소화하는 자일로스 선행 복합당 발효 시스템을 구축했습니다. 

  - 본 연구는 미생물 발효의 통제와 최적화를 위한 DOL의 장점을 명확하게 입증했습니다. 우리는 이와 유사한 전략이 세포룰로오스 가수분해물로부터 다양한 바이오연료와 바이오 화합물을 생산하는 데 적용될 수 있다고 기대합니다. 

연  구  결  과  문  답

이번 성과 뭐가 다른가

공간적 역할 분담 및 시간적 역할 분담을 통한 미생물 생태계의 정량적인 제어 기술 개발을 통해, 단일 균주가 하지 못하는 복잡하고 까다로운 일을 할 수 있는 미생물 생태계의 구축 방법을 제시했다. 

어디에 쓸 수 있나

단일 균주의 한계를 뛰어넘는 미생물 생태계를 정량적으로 구축할 수 있음. 

미생물 생태계 조절의 이해를 통해, 복잡한 대사경로를 필요로하는 유용 화합물 생산을 두 균주에 나눠서 진행할 수 있음. 

실용화까지 필요한 시간은

본 연구에서 개발한 ‘공간적 DOL, 시간적 DOL을 이용한 미생물 생태계 조절 전략’의 실용화를 위해서는 다양한 모델 미생물 생태계에서 제시된 공간적, 시간적 조건에 따른 역할 분담에 대한 실증 연구가 선행되어야 한다. 

실용화를 위한 과제는

1. 목질계 바이오매스에 함유된 HMF, levulinic acid에 대한 저항성 engineering. 

2. 화합물 생산 대사 경로가 서로 나뉜 미생물 생태계 구축

연구를 시작한 계기는

저는 박사 학위 때부터, 미생물을 이용해 고부가 물질을 만드는 미생물 발효에 관심이 많았습니다. 그런데, 한 균주로는 아무리 유전공학적 조작을 가해도 원하는 기능을 수행하게 하는 데에 한계가 있어 속상했습니다. 그러던 중, 자연계에 존재하는 미생물들은 서로 도움을 받으며 단일 균주가 수행하기 어려운 업무도 수행하며 살아간다는 사실을 알게 되었고 이에 ‘미생물 생태계’에 관심을 가지고 연구하게 되었습니다. 

에피소드가 있다면

본 연구성과는 시스템 대사 공학을 전문으로 하는 연구자, 수학적 모델링을 전문으로 하는 연구자가 서로 협업을 통해 이루어낸 결과입니다. 시스템 대사 공학자로써, 계산을 주로 하시는 분들과 함께 연구를 해보니 서로 생각하는 방식이 많이 다르다는 것을 알게 되었습니다. 그래서 처음에는 소통에 애를 먹었지만, 서로를 이해하고 더 많은 대화를 바탕으로 협력해서 연구를 진행하다 보니 논문에서 제시한 두 균주처럼 혼자는 결코 할 수 없는 일을 해내는 시너지를 만들었다고 생각합니다. 

꼭 이루고 싶은 목표는

미생물 생태계는 아직까지는 비교적 많은 연구가 되지 않은 상태입니다. 미생물 생태계를 구축하는 각 균주에 일을 효율적으로 분담하고, 조절하여 여러 균주의 시너지를 보여주는 것이 어렵기 때문입니다. 여기서 제시한 공간적, 시간적 DOL을 기반으로 단일 균주가 결코할 수 없는 일을 수행하는 미생물 생태계를 구축하는 것이 목표입니다. 

신진연구자를 위한 한마디

이 연구는 제가 미국에 박사 후 연구원으로 건너간 후 맡게 된 업무입니다. 연구가 뜻대로 진행되지 않아서 한국에 돌아온 후에 마무리가 되었지만, 그 과정에서 인내의 중요성과 믿음이라는 중요한 가치를 배우게 되었습니다. 처음 학위를 받고 박사 후 연구원으로써 연구를 시작했을 때는 앞이 보이지 않고 매우 막막할 것으로 생각합니다. 하지만, 어려워도 끝까지 포기하지 않는다면, 언젠가 순리대로 보답받을 것이라 믿습니다. 

그림1. 글루코스 및 자일로스 전문 효모 제작 [사진=한국생명공학연구원]
글루코스, 자일로스 각각을 선택적으로 소비하기 위해 내재되어 있는 당 수송 효소를 제거하고, 각 당에 특이적인 수송 효소를 발현시킴. 이후, 시스템 대사 공학을 통해 특정 당 소비 속도를 조절한 전문 효모를 제작함
a. 글루코스에 의한 자일로스 수송 저해가 일어나는 내재된 당 수송 효소 (Hxt1-7, Gal2), 글루코스 특이적 수송 효소(AtSweet1), 자일로스 특이적 수송 효소(LSNF)
b. 내재된 당 수송 효소가 제거되고, 각 당의 특이적인 수송 효소가 발현된 글루코스 및 자일로스 전문 효모
c. 글루코스 전문 효모가 복합당에서 선택적으로 당을 소비함을 확인
d. 자일로스 전문 효모가 복합당에서 선택적으로 당을 소비함을 확인

그림2. 구성 균주의 시작 농도를 바꿔 특정 당 소비 속도 조절 [사진=한국생명공학연구원]
a~e. 글루코스 전문 효모(YG)와 자일로스 전문 효모(YX) 농도를 1:9(a), 3:7(b), 5:5(c), 7:3(d), 9:1(e)로 바꿔 특정 당의 소비 속도를 확인
f. a~e에서 최대 에탄올 농도
g. 120시간 후 배지에 남아 있는 글루코스 및 자일로스 농도

그림3. 구성 균주의 접종 시간을 바꿔 특정 당 소비 속도 조절 [사진=한국생명공학연구원]
a. 당의 접종 시간을 나타낸 모식도파란색은 글루코스 전문 효모를 접종한 시간, 빨간색은 자일로스 전문 효모를 접종한 시간으로 YX0YG12-자일로스 전문 효모를 0시간, 글루코스 전문 효모를 12시간에 접종함을 나타냄
b. 두 전문 효모의 접종 시간에 따른 글루코스 소비 속도의 차이
c. 두 전문 효모의 접종 시간에 따른 자일코스 소비 속도의 차이글루코스 전문 효모의 접종 시간이 자일로스 전문 효모에 비해 선행될수록 자일로스의 소비 속도가 크게 감소함을 확인
d. 글루코스 전문 효모 0시간 자일로스 전문 효모 12시간
e. 글루코스 전문 효모 0시간 자일로스 전문 효모 0시간
f. 글루코스 전문 효모 12시간 자일로스 전문 효모 0시간일 때의 복합당 발효 프로파일까만 동그라미는 세포 농도 (OD600)을 나타내며, 파란 사각형 심볼은 글루코스 농도, 빨간 삼각형 심볼은 자일로스 농도, 노란 역삼각형 심볼은 각 시간 별 에탄올 농도를 나타냄

그림4. 미생물 생태계 내 글루코스 전문 효모, 자일로스 전문 효모의 수학적 모델링 [사진=한국생명공학연구원]
발효 결과를 정량적으로 이해하고 미생물 생태계 내 기질 공동 활용을 위한 설계 규칙을 설명하기 위해, 상미분 방정식(Ordinary differential equation) 기반 접근 방식을 사용하여 수학적 모델을 개발함
① 글루코스와 자일로스를 소비해 에탄올을 생산하는 효모 미생물 생태계를 기준으로 모델을 제작
② 이 방정식 모델은 각 효모의 탄소 대사를 통해 전구체(Rx, Rg), 글루코스(G), 자일로스(X), 세포 농도(Ng, Nx), 세포 유지 에너지(Mg, Mx), 산소(O), 조효소(Cx)가 항상 일정하게 보존됨을 원칙으로 제작
③ 에탄올은 자일로스의 수송(Jx)을 억제하고, 산소 농도가 자일로스 수송에 사용되는 등의 모델 구성 요소 간의 상호작용을 추가
④ 두 균주의 농도 총합 (Ng+Nx), 배지 내 글루코스 농도(G), 자일로스 농도(X)가 실험적으로 측정되고, 나머지 농도는 가상으로 설정되어 방정식 모델을 계산
* (검은 화살표)탄소 흐름, (주황 선)기질로부터의 억제 조절, (파란 화살표)조효소의 기여

그림 5. 수학적 모델링을 통해 예측된 공간적, 시간적 역할분담(DOL) 검증 [사진=한국생명공학연구원]
a. 공간적 DOL을 통한 미생물 생태계가 달성한 최대 에탄올 수율의 모델 예측과 실험 데이터의 비교(선 : 모델 예측,  원 : 실험 데이터)
b. 시간적 DOL을 통한 미생물 생태계가 달성한 최대 에탄올 수율의 모델 예측과 실험 데이터의 비교(선 : 모델 예측,  원/삼각형 : 실험 데이터)
c. 엔지니어링 된 미생물 생태계에 의한 목질계 바이오매스 발효의 시간적 프로파일