- IBS 한국바이러스기초연구소,‘21년 국내 발생 H5N1 바이러스 유전자 분석 -
- 세포·오가노이드 실험에서 바이러스 변이가 인체감염 가능성 높임을 입증 - 

조류인플루엔자(조류독감) 바이러스의 인체감염 우려가 증가하고 있다. 국내 감염 사례는 아직 없지만, 인접 국가인 중국을 비롯한 해외에서는 사례가 증가하는 추세다. 이러한 상황에서 국내에서 발생했던 조류인플루엔자 바이러스 역시 포유류 및 인체감염 가능성이 있음이 확인됐다.

기초과학연구원(IBS, 원장 노도영) 한국바이러스기초연구소 신변종 바이러스 연구센터 최영기 센터장 연구팀은 2021년 국내에서 발생한 H5N1형 고병원성 조류인플루엔자 바이러스를 분석한 결과, 변이로 인해 포유류 감염 가능성이 높아진 동시에 병원성도 증가했다는 사실을 입증했다. 

파타고니아의 물범 집단 폐사 등 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 피해와 더불어 인체감염 가능성에 대한 우려가 유럽, 북미 및 남미 대륙에서부터 점차 확산되고 있다. 우리나라를 포함한 아시아 지역에서는 주로 겨울 철새가 바이러스를 전파한다. 이 과정에서 다양한 재조합을 통해 돌연변이 바이러스가 만들어진다. 일부는 종간장벽을 넘어 인체감염을 일으키기도 한다. 조류인플루엔자 바이러스는 인류에게 20세기에 3차례, 21세기에 1차례의 팬데믹을 일으켰던 바이러스의 일종이기 때문에, 고병원성 바이러스를 추적하고 변이 바이러스 출현 여부 및 인체 감염성을 평가하는 연구는 팬데믹 발생 및 전파에 대비하기 위해 필수적인 연구라고 할 수 있다.

IBS 연구진은 2021년 국내 발생한 H5N1형 고병원성 조류인플루엔자 바이러스의 유전자를 분석한 결과, 바이러스가 숙주 세포 수용체에 결합하는 부위인 항원성 돌기(헤마글루티닌)에 변이가 발생했음을 발견했다.

연구진은 변이 부위 아미노산만을 치환한 재조합 바이러스를 제작하여 세포 및 동물에서 변이의 영향력을 평가했다. 기존 바이러스와 변이 바이러스의 세포 수용체 결합력을 비교한 결과, 변이 바이러스는 조류의 수용체뿐만 아니라 표유류의 수용체에도 향상된 결합력을 나타냈다. 조류, 포유류 및 인체 유래 세포를 이용한 감염 실험에서도 변이 바이러스는 기존 바이러스와 비교하여 인체 유래 세포에 대한 향상된 감염성을 보였다.

동물실험 시 조류(닭)에서는 기존 바이러스와 비슷한 증식성 및 병원성을 보였으나, 쥐나 페렛 실험에서는 증식성과 병원성이 모두 높아졌다. 페렛에게 기존 바이러스와 변이 바이러스를 동량으로 혼합해 감염시켰을 때, 시간이 지날수록 변이 바이러스가 우세하게 증식했다. 또한, 직접 접촉을 통해 바이러스 전파가 일어났으며, 전파가 일어난 바이러스는 모두 변이 바이러스임을 확인했다.

이어 연구진은 인체감염 가능성을 평가했다. 인체 유래 기관지 상피세포 오가노이드에 바이러스를 감염시켜 분석한 결과, 변이 바이러스는 인체 유래 인플루엔자와 비슷한 감염양상 및 증식성을 보였다. 바이러스에 생긴 변이가 인체감염 가능성을 증가시켰다는 의미다.

연구를 이끈 최영기 센터장은 “고병원성 조류인플루엔자 바이러스의 수용체 중 특정 아미노산 치환(변이)으로 인해 포유류 및 인체감염 가능성을 향상시킬 수 있는 바이러스로 변화할 수 있으며, 이러한 변이가 아시아 지역에서 점차 증가하고 있음을 실험과 대용량 유전체 정보 분석을 통해 규명한 성과”라며 “향후 이들 바이러스를 신속 정확하게 진단할 수 있는 진단법 개발 및 인체감염에 대비할 수 있는 백신 개발연구에 기여할 것으로 기대한다”고 말했다.

연구 결과는 1월 8일 국제학술지 ‘신종 미생물 및 감염(Emerging Microbes & Infections, IF 13.2) 온라인판에 게재됐다.

논문/저널/저자

HA N193D substitution in the HPAI H5N1 virus alters receptor binding affinity and enhances virulence in mammalian hosts / Emerging Microbes & Infections(2024)

Seung-Gyu Jang, Young-Il Kim, Mark Anthony B. Casel, Jeong Ho Choi, Ju Ryeon Gil, Rare Rollon, Eun-Ha Kim, Se-Mi Kim, Ho Young Ji, Dong Bin Park, Jungwon Hwang, Jae-Woo Ahn, Myung Hee Kim, Min-Suk Song, Young Ki Choi

연구내용 보충설명

[연구배경] 조류인플루엔자 바이러스는 8개의 유전자 분절(PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS)을 가진 RNA 바이러스로, 각 유전자 분절이 재조합되거나 유전자 내에 변이가 일어나는 방식으로 다양한 유전형 및 변이를 가진 바이러스가 생긴다. 따라서 인체에 감염되거나 유행할 가능성이 높은 바이러스에 대해 매년 백신 균주를 업데이트 하지만, 이러한 업데이트에도 불구하고 숙주의 면역 회피를 위한 변이로 인해 종종 감염이 일어나게 된다. 조류에서 존재하는 바이러스가 종간장벽을 넘어 인간에게 감염되는 사례에는 다양한 변종 바이러스들이 보고됐다. 향후 발생 가능한 인체감염 여부에 대해 모니터링하고 분석하는 것은 매우 중요한 연구이다.

[보충설명] 

이번 연구에서는 2021~22년 겨울철에 국내로 유입된 철새에서 분리한H5N1형 고병원성 조류인플루엔자 6종의 유전자를 분석했다. 2종의 바이러스에서 숙주 세포 수용체에 결합하는 바이러스 HA 유전자 193번 아미노산이 기존의 아스파라긴(N)에서 아스파르트산(D)으로 변이가 발생한 것을 확인하였다. 이러한 변이가 미치는 영향을 분석하고자 HA-193D를 가진 변종바이러스(W811-HA193D)의 클론 바이러스를 제작하였고, 여기에서 기존의 바이러스가 가진 HA-193N을 갖도록 site direct mutaion을 통해 W811-HA193N바이러스를 제작하여 비교 실험을 수행하였다.

수용체 결합력 비교 실험에서, W811-HA193N바이러스는 기존의 조류인플루엔자와 같이 조류형 수용체인 시알산 α2,3에만 결합하였으며, W811-HA193D바이러스는 조류형 수용체 뿐만이 아니라 인간형 시알산 α2,6에도 결합력을 나타내 HA-N193D 변이가 두 가지 타입 모두의 수용체에 결합력을 획득하게 되었음을 확인했다.

두 바이러스를 이용한 세포 실험에서, 닭 유래의 세포(CEF, DF-1), 포유동물 유래 세포(MDCK), 그리고 인간 유래 세포(A549, Calu-3, HBE)에서 증식성을 비교 분석하였다. 분석 결과 닭 유래의 세포에서는 두 바이러스가 유의성을 보이지 않고 증식했으며, MDCK세포 및 인간 유래 세포에서는 W811-HA193D바이러스가 유의성있게 향상된 증식성을 나타냈다.

생체 내 실험에서의 증명을 위해 닭, 마우스, 페렛 동물모델을 이용한 감염 실험에서, 닭에서는 두 바이러스가 비슷한 병원성을 나타낸 반면 마우스에서는 W811-HA193D바이러스가 10배 정도 높은 병원성을 나타냈다.

더 나아가 페렛 동물에서의 감염 실험에서는 W811-HA193D바이러스를 감염한 페렛의 비강 분비물에서의 바이러스 역가가 W811-HA193N바이러스를 감염한 페렛에서 보다 유의성 있게 높았다. 또한, 감염하지 않은 페렛을 접촉시켰을 때, W811-HA193D바이러스 감염 그룹에서는 전파가 일어나 감염하지 않은 페렛에서도 혈청 전환이 일어났다.

이후 W811-HA193D바이러스의 증식성 및 전파력을 좀더 명확하게 분석하기 위해 두 변이 바이러스를 동량으로 혼합한 후 페렛에 감염하였고, 비강 분비물에서 두 바이러스의 증식 비율을 NGS 방식을 적용하여 분석했다. 분석 결과, 시간이 갈수록 W811-HA193D바이러스가 99%이상을 차지하며 우점종이 되었고, 감염하지 않은 페렛에 접촉을 통해 전파가 일어난 바이러스는 모두 W811-HA193D바이러스로 나타났다. 인플루엔자 바이러스의 인체 감염 동물로 잘 알려진 페렛 동물에서의 경쟁 증식력 실험을 통해 W811-HA193D바이러스는 인체 감염 및 전파의 가능성이 있음을 시사하였고, 한단계 더 나아가 인체 유래 기관지 세포의 오가노이드를 이용한 감염실험을 수행하였다. 인체유래 오가노이드 감염실험을 통해 W811-HA193D바이러스는 기존의 W811-HA193N바이러스를 포함한 고병원성 조류인플루엔자 (W795)보다 월등히 높은 감염력 및 증식성을 나타내었고, 이는 감염된 오가노이드를 사용한 형광면역염색과 RNAscope 실험을 통해 시각화 되었다. 이렇게 자연계에서 발생한 고병원성 조류인플루엔자 바이러스의 특이 변이가 인체 감염 가능성을 향상시켰음을 입증하였다.

연구 이야기

[연구 과정] 

본 연구를 수행하기 위해 가장 먼저 국내에 유입된 철새의 분변을 샘플링하여 바이러스를 분리해야 했다. 이후 분리된 조류인플루엔자 바이러스가 고병원성인지를 판별하여 고병원성임이 확정되면 국가기관에 분리 신고 및 연구를 수행할 수 있도록 허가 절차를 통해 승인 후에만 실험을 시작할 수 있다. 특정 변이 부분의 영향력을 입증하기 위한 실험이었기에, 다른 유전자 서열은 모두 동일하지만 특정 변이 부위만 다른 두 종류의 재조합 바이러스를 제작한 후 모든 연구 과정에서 비교 실험을 수행했다.

[어려웠던 점] 

고병원성 조류인플루엔자는 특별관리병원체로 지정되어 있으며, 이를 이용한 모든 실험은 생물안전3등급 연구시설(BSL-3)에서만 가능하다. 이는 병원체 취급시 안전을 최우선으로 함과 동시에 고도의 집중력을 필요로 하기에 시설 내에서 상당한 경험이 있는 연구인력만이 실험을 수행할 수 있다. 세포를 이용한 실험 뿐만 아니라, 닭, 마우스, 페렛과 같은 다양한 동물을 이용한 바이러스 감염 실험 및 중화항체 테스트, 감염한 동물에서의 조직 수집, RNA추출 등 까다롭고 복잡한 과정을 거쳐 본 성과를 얻을 수 있었다.

[성과 차별점] 

세포 및 동물실험을 통해 병원성의 차이를 분석하는 것은 기존의 연구에서 변이 바이러스의 영향력을 입증하는 연구 방법으로 사용되었다. 이번 연구 성과에서는 기존의 연구 방법과 차별적으로 동물 내에서 바이러스의 경쟁 증식성 분석에 NGS 방식을 적용하여 분석하였으며, 인체 유래 오가노이드를 이용하여 인체 감염 가능성을 명확하게 입증하였다. 이 단계에서 연구소에 신규 구축한 다중 표지자 형광 면역 염색장비(AKOYA)를 통해 보다 명확한 세포로의 바이러스 감염양상을 분석하여 결과를 제시할 수 있었다. 

[향후 연구계획] 

매년 발생하고 있는 고병원성 조류인플루엔자 바이러스의 인체감염 가능성 평가를 지속적으로 수행할 계획이며, 새롭게 출현한 변종 바이러스에 대해 기존 백신 및 치료제의 효능평가 연구를 수행하고자 한다.

[그림1] 조류 인플루엔자 바이러스의 숙주 세포 수용체 결합 부위 [사진=기초과학연구원] (A) 2006년부터 국내에서 분리되었던 H5형 조류인플루엔자 분리주들과 2021년도에 분리된 CT/W811(H5N1) 바이러스의 헤마글루티닌 수용체 결합 도메인의 아미노산 비교.
(B) 조류인플루엔자 H5형 헤드 도메인 구조는 아미노산 변화에 의해 변경된 HA-193번 부위의 잔기를 표현하며(청보라색=탄소, 빨간색=산소, 파란색=질소), 아스파르트산(D)과 아스파라긴(N)은 각각 노란색과 자홍색으로 강조 표시됨.[그림 2] 두 변이 바이러스의 수용체 결합 선호도 비교 [사진=기초과학연구원] (A) 시알산α2,3 및 α2,6 글리칸에 대한 바이러스의 결합 친화력을 비교하기 위해 CA04(인체유래 인플루엔자), W401/W795(조류유래 인플루엔자) 바이러스를 양성 대조군으로 사용함. HA-193번 부위만을 D또는 N으로 치환한 재조합 바이러스를 비교시 HA-193N 바이러스는 조류형 수용체인 시알산 α2,3에만 결합하는 양상을 보이며, HA-193D 바이러스는 조류형 수용체인 시알산 α2,3 및 인간형 수용체 시알산α2,6 모두에 결합력을 보임.

[그림 3] 두 변이 바이러스의 경쟁적 증식 및 전파 [사진=기초과학연구원] (A) HA-193N 및 HA-193D 바이러스를 페렛동물에서의 경쟁적 증식력 비교시험을 위해 동량의 두 바이러스를 페렛에 감염 후 비강 분비물에서의 바이러스 RNA를 qPCR로 정량함. 감염하지 않은 페렛에서도 직접 접촉을 통해 바이러스가 전파되어 바이러스 RNA가 검출됨.
(B) HA-193N 및 HA-193D 바이러스를 동량으로 페렛에 감염하였을 때, 감염 후 시간이 지남에 따라 HA-193D 바이러스가 우세적으로 증식하였음. 감염하지 않은 페렛에서는 직접 접촉 후 3일째부터 바이러스 RNA가 검출되었고, 검출된 바이러스는 100% HA-193D 바이러스임이 확인됨.

[그림 4] 두 변이 바이러스의 인체 유래 호흡기 세포 감염력 및 증식성 비교 [사진=기초과학연구원] (A) HA-193N 및 HA-193D 바이러스를 인체 기관지 상피세포(HBEpC)의 공기-액체 상호작용(ALI culture) 방식으로 배양한 오가노이드에 감염 후 시알산 α2,3 및 α2,6의 발현에 따른 감염양상(인플루엔자 NP)을 다중표지 형광면역 방법으로 확인함.
(B) 바이러스를 감염한 오가노이드에서 RNA scope 방법을 이용하여 바이러스 RNA(빨간색)를 검출하여 감염양상을 비교함. 오가노이드 세포는 바이러스 감염 후 시간이 지남에 따라 사멸하여 Mock 대비 두께가 감소하였음을 확인함(H&E staining).