초기 발견이 어려운 대장암을 조기 진단할 수 있는 기술이 개발됐다. 

한국연구재단(이사장 이광복)은 박기수 교수(건국대학교) 연구팀이 SELEX 기술*을 활용해 대장암 조기 진단 및 치료에 활용할 수 있는 DNA 압타머**를 개발했다고 밝혔다. 

 * SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) : 표적 물질에 특이적으로 결합하는 압타머 선별 기술

 ** 압타머(Aptamer): 단일, 이중 나선의 DNA, RNA 형태로 타깃 단백질과의 3차원적 결합을 통해 단백질의 상호작용을 억제하는 생고분자 물질

대장암은 종양 이질성*이 높아 진단 및 치료가 어려운 암종으로 알려져 있다.

 * 종양 이질성: 종양 내 다양한 세포 집단이 존재하는 것을 말하며, 서로 다른 세포 집단이 화학 요법 약물 또는 표적 치료에 다양한 민감도를 보인다는 특징이 있음

대장암 예방 및 치료의 큰 발전에도 불구하고, 특정한 증상과 정확한 바이오마커*의 결핍으로 대장암의 조기 발견 및 생존율 예측은 여전히 부족한 상황이다. 

 * 바이오마커: 단백질이나 DNA, RNA(리보핵산), 대사 물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표

따라서 대장암의 효과적인 진단을 위해선 대장암에만 특이적인 바이오마커를 탐색하는 것이 매우 중요하다.

이에 연구팀은 액체생검*의 핵심 바이오마커로 활용되는 대장암 유래 엑소좀(exosome)*에 특이적으로 결합하는 압타머를 발굴하기 위해 SELEX 기술을 설계 및 도입, 압타머 후보군을 대상으로 한 최적화 과정을 통해 결합 능력이 가장 우수한 압타머를 선별했다.

 * 엑소좀(exosome): 세포에서 유래한 나노 단위 크기의 소포로, 세포 간 신호 전달 역할을 함

 ** 액체생검(liquid biopsy): 혈액이나 복수 등 체액 샘플을 통해 종양에 대한 다양한 정보를 얻을 수 있는 비침습적인 검사방법

최종적으로 선별된 압타머는 비표적 엑소좀(정상 혈청 및 다른 암세포 유래 엑소좀)에 비해 대장암 세포 유래 엑소좀에 대한 높은 특이성을 보였으며, 혈청 또는 혈장 농도 범위 내에서 대장암 세포 유래 엑소좀을 검출하기에 충분한 감도를 갖는 것을 확인했다. 

또한, 전이성이 없는 대장암 세포를 이용해 전이성 대장암 유래 엑소좀이 세포간 신호 전달에 관여하여 발생하는 전이 능력을 확인한 결과, 압타머가 결합하면 엑소좀에 의한 신호 전달이 억제됨을 상처 치유 분석 및 세포 이동·침습 분석을 통해 입증했다. 

본 연구를 통해 개발된 기술은 대장암뿐만 아니라 다양한 고형암에 적용 가능하며, 암의 조기 진단 및 항암제 내성과 관련된 엑소좀 바이오마커 선별에 기여해 환자 맞춤형 치료를 가능케 할 것으로 예상된다.

박기수 교수는 “엑소좀 및 압타머의 대장암 진행 및 전이에 기여하는 기전에 대한 추가연구가 필요하다”며, “압타머가 결합하는 바이오마커에 대한 정밀한 연구가 지속적으로 이루어져야 한다”고 설명했다.

과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 우수신진 연구사업의 지원으로 수행된 이번 연구 성과는 생체재료/생물의학공학 분야 국제학술지‘어드밴스드 헬스케어 메터리얼즈(Advanced Healthcare Materials)’의 10월 27일 표지논문으로 선정되었다. 

주요내용 설명

<작성 : 건국대학교 박기수 부교수>

논문명
Development of a Novel DNA Aptamer Targeting Colorectal Cancer Cell-Derived Small Extracellular Vesicles as a Potential Diagnostic and Therapeutic Agent

저널명 
Advanced Healthcare Materials

키워드 
Aptamers(압타머), Colorectal cancer(대장암), Diagnostics(진단법), E-SELEX(엑소좀-셀렉스), Small extracellular vesicles(엑소좀), Therapeutics(치료법)

DOI
doi.org/10.1002/adhm.202300854

저  자
박기수 교수(교신저자/건국대학교), 차병석 박사(제1저자/건국대학교), 장영준 석사(제1저자/건국대학교), 이은성 박사(제1저자/건국대학교)

1. 연구의 필요성

○ 전 세계 건강관리 문제에 대한 큰 위협인 대장암(Colorectal cancer, 이하 ‘CRC)은 전 세계적으로 세 번째로 많이 진단되는 암이자 두 번째로 많은 암 사망 원인임. 2020년 통계에 따르면, 대장암은 전 세계 암 진단의 10%와 암 사망률의 9.4%를 차지함. 대장암의 종양성 진행은 유전적 돌연변이, 후성 유전 변형 및 환경적 요인 등의 복합적인 상호작용에 기인함. 이러한 진행은 다양한 장기, 특히 간에서 재발 및 전이를 촉진함.

○ 대장암은 특히 높은 종양 이질성 특징을 지니므로 진단 및 치료가 어려운 암종으로 알려져 있음. 대장암 예방 및 통제의 큰 발전에도 불구하고, 특정한 증상과 정확한 바이오마커의 결핍으로 대장암의 조기 발견 및 생존율 예측은 여전히 부족한 상황임. 따라서 대장암의 효과적인 진단을 위해 대장암 특이적 바이오마커를 탐색하는 것이 매우 중요함. 

○ 작은 세포외 소포체(small extracellular vesicles, sEVs)로도 알려진 엑소좀 (exosomes)은 모든 세포 유형에서 세포외로 분비되는 나노 크기의 지질 막으로 둘러싸인 소포체(직경 50-200 nm)임. 엑소좀은 DNA, RNA 및 단백질 등 다양한 생체 활성 분자를 운반해 기원 세포와 수용 세포 사이의 세포 간 신호전달을 국부적이고 체계적으로 매개함. 특히, 종양 세포에서 유래한 엑소좀은 암 발달, 진행, 침습 및 전이의 조절자 역할을 함. 점점 더 많은 연구에서 CRC 유래 엑소좀의 잠재적 응용이 입증되고 있음. 예를 들어, 엑소좀 마이크로RNA (miRNA), 긴 비암호화RNA (lncRNA), 메신저RNA (mRNA) 및 단백질의 발현 패턴은 CRC에서 상향 조절되며, 이는 CRC에 대한 진단 가능성을 향상시킴. 또한 전이, 화학내성 및 재발을 포함하여 CRC 예후에 대한 후보 엑소좀 바이오마커가 확인됨. 인체 체액을 순환하는 엑소좀은 모세포를 반영하고 있음으로 간주되며, 이를 통해 대장암의 비침습적 진단이 가능함.

○ 압타머는 특정 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 가닥의 DNA나 RNA로서 높은 안정성, 작은 크기, 합성 용이성 및 변형, 낮은 면역원성, 높은 결합 친화성 및 특이성 등과 같은 탁월한 장점으로 인해 진단 및 치료제 개발과 바이오마커 발굴에 있어 큰 주목을 받고 있음. 압타머는 일반적으로 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)에 의한 리간드의 체계적인 진화라고 하는 반복적인 시험관 내 선택 과정을 통해 선별됨. SELEX는 표적에 대한 사전 정보 없이도 세포, 조직 및 생체 내 모델과 같은 자연 형태를 유지하는 모든 생물학적 개체에 대해 압타머를 얻을 수 있다는 장점을 지님. 

2. 연구내용 

○ 대장암 유래 엑소좀에 특이적인 압타머를 발굴하기 위해 ‘E-SELEX’ 기술을 설계 및 도입함. 네 번의 연속적인 양성 선택(positive selection)과 한 번의 대항 선별(counter selection)로 구성된 루프를 총 세 번 반복하는 E-SELEX 진행하여 압타머 후보군을 회수함. 

○ 회수한 압타머 후보군을 NGS(Next Generation Sequencing)을 활용해 분석하여 frequency(%) 기반 상위 10개의 압타머 후보를 선별하고 결합 친화도를 평가함. 마지막으로, 선별된 압타머를 post-SELEX 최적화 과정을 통해 결합능력이 가장 우수한 최적의 압타머 서열을 선별함. 최종적으로 선별된 압타머는 3.41nM의 Kd(결합해리상수)값을 지니며, 혈청 또는 혈장 농도 범위 내에서 대장암 세포 유래 엑소좀을 검출하기에 충분한 감도를 갖는 것을 확인함. 또한 비표적 엑소좀(정상 혈청 및 다른 암세포 유래 엑소좀)에 비해 대장암 세포 유래 엑소좀에 대한 높은 특이성을 보임. 

○ 선별한 최적의 압타머가 결합하는 표적이 엑소좀의 외막에 위상적으로 위치함을 바이오 마커 분석을 통해 확인함. 전이성이 없는 대장암 세포와 전이성이 높은 대장암 세포 유래 엑소좀을 이용하여 엑소좀 매개 세포간 신호전달에 관여하는 전이 발생을 확인하고, 압타머와의 결합이 엑소좀의 신호전달과정을 억제하는 것을 상처 치유 분석 및 세포 이동/침습 분석을 통해 입증함. 더 나아가, 압타머가 결합한 엑소좀이 항혈관신생효과를 지님을 입증함. 

3. 연구성과/기대효과

○  본 연구팀이 개발한 대장암 진단 및 치료용 DNA 압타머 기술은 압타머를 활용하여 높은 친화성 및 특이성으로 대장암 진단이 가능하고, 대장암 유래 엑소좀과 특이적으로 결합하여 엑소좀 매개 암 전이성을 억제할 수 있는 잠재력을 지님으로 치료 가능성을 확인한 기술임.

○ 본 연구에서 제안된 E-SELEX 방법을 이용한 압타머 및 바이오마커 선별은, 엑소좀 바이오마커에 대한 선행 정보 없이, DNA/RNA Random Library와 엑소좀간의 반복적인 상호작용을 통하여 최고의 결합력을 보이는 압타머와 바이오마커를 발굴한다는 점에서 큰 차별성이 있음. 또한, 선별된 압타머 및 엑소좀 바이오마커 정보를 기반으로 개발되는 초고감도 분석 시스템은 향후 대장암의 조기 진단을 가능하게 하여 생존율을 획기적으로 향상시킬 것으로 예상됨. 

○ 본 연구를 통해 개발되는 기술은 대장암뿐만 아니라 다양한 고형암(폐암, 췌장암, 위암 등)에 적용 가능하며, 암의 조기 진단 및 항암제 내성과 관련된 엑소좀 바이오마커의 선별에 큰 기여를 하여 환자 맞춤형 치료를 가능하게 할 것으로 예상됨. 

○ 본 연구 개발 과제 성과로 핵심 원천기술의 확보를 통해 연간 약 1000조원 규모의 글로벌 진단 및 검출 시장에서 선도적 위치를 선점할 수 있을 것으로 예상됨.

(그림1) 대장암 엑소좀에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 선별하는 기술인 E-SELEX(a) 및 DNA 압타머 특성화 분석(b) 모식도대장암 세포 유래 엑소좀에 대한 높은 결합성 및 특이도를 지닌 DNA 압타머를 분리하기 위해 양성 및 대항 선별을 포함한 E-SELEX 수행함. 최종 얻어진 압타머 후보의 서열을 차세대 염기서열 분석(NGS)로 분석하고, 압타머의 결합 특성과 진단 및 치료 응용 가능성을 분자 및 세포 수준의 실험을 통해 평가함.
그림설명 및 그림제공 : 건국대학교 박기수 부교수 

(그림2) 압타머 CCE-10F의 특성화 및 대장암 엑소좀 및 압타머-엑소좀 복합체의 전이성 효과 평가

(a) 대장암 엑소좀에 대한 CCE-10F의 결합해리상수 (Kd)를 분석함. (b) CCE-10F의 결합 민감도를 분석함. (c) CCE-10F의 결합 특이성을 분석함. (d) 상처치유효과를 분석함. (e) 세포이동능효과를 분석함. (f) 세포칩습능효과를 분석함. (g) 항혈관신생효과를 분석함.
그림설명 및 그림제공: 건국대학교 박기수 부교수 

(그림3) 어드밴스드 헬스케어 메터리얼즈(Advanced Healthcare Materials)’ 표지논문(Front cover)E-SELEX를 통해 최종 선별한 압타머를 이용하여 대장암 유래 엑소좀에 대한 높은 결합성과 특이성을 기반으로, 비침습적 진단뿐만 아니라 엑소좀 매개 암 전이성을 억제하는 치료 가능성을 확인한 가치 있는 연구로 판단되어 표지논문으로 선정됨.
그림설명 및 그림제공: 건국대학교 박기수 부교수 

연구 이야기                   

<작성 : 건국대학교 박기수 부교수>

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

- 대장암은 높은 종양 이질성을 지녀 진단 및 치료가 어려운 암종으로 알려져 있습니다. 대장암 예방 및 치료의 큰 발전에도 불구하고 특정 증상과 정확한 바이오마커의 부족으로 대장암 검출 및 생존율 예측이 정확하지 않습니다. 따라서 대장암의 효과적인 진단을 위해 대장암 특이적 바이오마커를 탐색하는 것이 중요해졌습니다. 

- 특정 표적에 결합할 수 있는 단일 가닥 DNA 또는 RNA인 압타머는 높은 안정성, 작은 크기, 합성 및 변형 용이성, 낮은 면역원성, 높은 결합 친화성 및 특이성 등의 탁월한 장점으로 인해 진단, 치료제 개발 및 바이오마커 발굴 분야에서 큰 주목을 받고 있습니다. 

- 또한, 정확한 표적물질의 사전 정보 없이도 진행이 가능한 반복적인 시험관 내 선택 과정인 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)를 활용하여 대장암에 특이적으로 결합하는 압타머를 선별하여 바이오마커를 분석하는 연구를 진행하게 되었습니다.

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

- 대장암 세포 및 정상 혈청 유래 엑소좀을 활용하여 네 번의 연속적인 양성 선별과 한 번의 대항 선별로 구성된 루프를 총 세 번 반복하는 E-SELEX를 설계하였습니다. 비대칭-PCR(Asy-PCR)를 활용하여 ssDNA 라이브러리의 증폭을 단순화하였고, 각 단계마다 qPCR를 진행하여 회수한 ssDNA의 균질성을 확인하였고 이에 따라 적절한 루프 수를 선정하였습니다.

- 회수한 압타머 후보군을 NGS 및 ELONA를 활용하여 최상의 압타머를 선별하였습니다. 최종적으로 선별된 압타머는 3.41nM의 결합해리상수(Kd) 값과 혈청 또는 혈장 농도 범위 내에서 대장암 세포 유래 엑소좀을 검출하기에 충분한 감도를 갖는 것을 확인하였습니다. 또한 정상 혈청 세포 및 다른 종류의 암세포 유래 엑소좀과 같은 비표적 엑소좀에 비해 대장암 세포 유래 표적 엑소좀에 대한 높은 특이성을 확인하였습니다.

- 선별한 최적의 압타머는 엑소좀과 결합시 압타머 단독보다 혈청의 뉴클레아제에 대해 더 높은 저항성을 보여 대장암 바이오마커 검출에 대한 실용화 가능성을 보였습니다. 선별한 최적의 압타머가 결합하는 표적이 엑소좀의 외막에 위상적으로 위치함을 바이오 마커 분석을 통해  확인하였습니다. 또한, 세포 독성 및 흡수 분석에서 압타머는 엑소좀 결합과 무관하게 아무런 영향을 미치지 않는 우수한 생체 적합성을 보였습니다. 

- 전이성이 없는 대장암 세포를 이용해 전이성 대장암 유래 엑소좀이 세포간 신호전달에 관여하여 발생하는 전이 능력을 확인하고, 압타머가 결합되면 엑소좀에 의한 신호전달이 억제됨을 상처 치유 분석 및 세포 이동/침습 분석을 통해 입증하였습니다. 추가로, 이와 같은 경향으로 압타머가 결합된 엑소좀이 항혈관신생 효과를 발휘할 수 있음도 확인했습니다.

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소는 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

- 세포로부터 방출되는 엑소좀은 세포의 상태와 환경에 따라 많은 영향을 받습니다. 따라서 동일한 세포를 사용하더라도 세포 배양 배지의 구성 요소 및 세포의 노화 상태 등 다양한 요인에 의해 엑소좀의 특성이 달라질 수 있습니다. 이러한 변이는 SELEX 과정 진행 및 압타머와 엑소좀 간의 결합 특성 분석에 큰 장애물이었습니다. 이 문제를 극복하기 위해 세포 passage 및 엑소좀 추출의 프로토콜을 정립하여 최대한 일정하게 유지했으며, 분리한 여러 엑소좀의 특성을 비교 분석하여 최상의 엑소좀을 선별하여 이후 실험에서 동일한 경향의 결과를 성공적으로 얻을 수 있었습니다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가? 

- 암에 대한 바이오 마커를 검출하기 위한 기존의 SELEX들은 대부분 암세포나 단일 단백질로 진행었습니다. 하지만, 세포의 경우 비특이적인 세포의 섭식과 세포의 상태유지 등 여러 어려움이 존재하고 있으며, 단일 단백질의 경우 실제 생체 내에서 발현된 상태 및 구조를 온전히 반영하지 못한다는 단점이 있습니다. 본 연구의 E-SELEX 기술은, 엑소좀을 사용하기 때문에 세포 및 단일 단백질을 사용하는 경우 발생할 수 있는 단점들을 모두 극복이 가능합니다.

- 바이오마커와 결합할 수 있는 생체 물질인 항체는 본 연구의 압타머 대비 합성 및 변형 용이성, 안정성 및 면역원성 등 다양한 측면에서 단점을 가지고 있습니다. 따라서, 압타머는 대장암 검출에 뛰어난 범용성을 제공하는 장점이 있습니다.

- DNA 압타머는 다양한 형태로 자유롭게 변형이 가능하고 국소, 경장 또는 비경구 적용과 같은 다양한 투여 경로로 통해 체내 투입이 가능합니다. 

- 본 연구가 검증한 결과에 따르면, 압타머는 엑소좀과 결합하여 대장암 진행 기작을 저해하 합니다. 이를 통해 압타머가 결합하는 바이오마커는 대장암 진행 및 발달에 관여하는 것을 알 수 있습니다. 이를 토대로, 본 연구로 발굴된 압타머는 최초의 목표였던 대장암의 검출과 더불어 치료까지 동시에 가능한 잠재력을 가지고 있습니다. 

- 압타머가 대장암에 특이적으로 작동하므로, 대장암 표적 약물, 암세포 사멸을 유발하는 톡신 및 항암제를 담지한 리포좀 또는 나노입자 표면에 압타머를 부착하여 대장암 병변 부위로 전달되도록 유도할 수 있습니다. 따라서, 개발한 압타머는 대장암 특이적 약물 전달 시스템에 활용될 수 있습니다.  

- 이러한 우수성을 바탕으로 본 연구가 개발한 E-SELEX 기술은 다양한 바이오 마커의 발굴 및 진단을 위한 핵심 원천 기술로 활용이 가능합니다.

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?

- 진단용 센서, RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 및 단백질 칩 키트와 같은 다양한 분자진단키트로 제품화하여, 공항 및 항만과 같이 대량의 샘플 분석이 필요한 공공장소와 개인병원 및 개인이 집에서 자가 진단을 필요로 하는 분야에서 활용이 가능합니다. 

- 대장암 세포 유래 엑소좀에 압타머가 특이적으로 결합하는 특성을 활용해, 환자의 대장암 엑소좀에 압타머가 결합하도록 하여 암의 진행을 저해시켜 대장암의 치료에 이용할 수 있습니다. 또한, 압타머를 리포좀이나 나노입자의 표면에 부착함으로써, 리포좀이나 나노입자 내부에 탑재된 항암제, 톡신, 암성장 저해 유전자, siRNA (small interfering RNA) 등을 대장암 세포 유래 엑소좀에 선택적으로 전달할 수 있다. 본 발명은 상기 DNA 압타머를 함유하는 대장암 특이적 약물전달 조성물의 형태로 제공될 수 있습니다.

- 압타머를 대장암 치료에 적용하기 위해서는 압타머가 결합하는 바이오마커의 상세한 분석이 필요합니다. 바이오마커를 규명하고 대장암 발달에 관여하는 기전 및 압타머가 관여하는 메카니즘에 대한 상세한 연구가 필요하며, 달성 시 실용화를 통한 기대효과는  것으로 예상됩니다.

□ 꼭 이루고 싶은 목표나 후속 연구계획은? 

- 실험실에서 개발된 기술을 실제 산업 현장에서 활용될 수 있도록 제품화하고 실용화하는 것을 목표로 하고 있습니다.

- SELEX 와 post-SELEX 과정을 간소화시켜 시간과 비용을 절감시키는 것을 목표로 하고 있습니다. 

- 대장암의 진단과 치료를 동시에 가능한 시스템을 구축할 계획이며, 다양한 질병으로의 확장 가능성을 검증하고자 합니다.

□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?

- 엑소좀의 특성 분석 과정에서 실제 이미지를 얻는 TEM 촬영에 어려움을 겪고 있었습니다. 이를 위한 방안을 찾던 중 서울대의 Cryo-TEM기기를 대여하여 사용할 수 있는 제도를 발견하였고, 값비싼 기기를 비교적 적은 돈으로 사용 및 전문 테크니션의 도움을 받을 수 있어 만족스러운 엑소좀 이미지를 얻을 수 있었습니다.

- COVID-19 사태로 인해 실험 진행 중 몇몇 재료의 수급에 문제가 생겨 실험이 지연될뻔한 적이 종종 있었습니다. 이를 해결하기 위해, 주변 실험실 및 여러 업체와 연락하여 재료를 수급하는데 성공해 무사히 실험을 진행할 수 있었습니다.