- KAIST 생명화학공학과 이상엽 특훈교수 연구팀, 15종 박테리아에서 효과적으로 작동하는 유전자 억제 기술 개발
 - 대표적인 그람 음성 및 양성 병원균의 독성인자를 억제하여 병원성이 현저히 억제됨을 확인
 - 코리네박테리움의 유전자 회로를 조작하여 다양한 고부가가치 화합물을 재생 가능한 친환경 원료로부터 고효율로 생산함
 - 합성생물학과 대사공학 분야 플랫폼 기술로서 널리 활용 기대 
 

<KAIST 이상엽 교수>

박테리아는 우리 일상에서 김치, 된장, 술 등 식품에 활용되어 왔을 뿐만 아니라 최근에는 대사 공학을 통해 플라스틱, 영양제, 사료, 의약품 등을 생산하는 산업용 세포 공장으로 활약하고 있다. 하지만 유익한 박테리아 외에도 다양한 감염성 질병을 일으키는 폐렴균, 살모넬라균 등 병원균이 있어 대사공학적 기법을 통해 유해한 병원균은 병원성을 억제하거나 사멸을 유도하고, 유익한 산업용 박테리아는 고부가가치 물질을 고효율로 생산할 수 있도록 조작하는 것이 중요하다.

KAIST(총장 이광형)는 생명화학공학과 이상엽 특훈교수 연구팀이 그람 음성균과 양성균 모두를 포함한 다양한 박테리아에서 표적 유전자를 효과적으로 억제할 수 있는 신규 sRNA 도구를 개발했다고 10일 밝혔다. 해당 연구 결과는 국제 학술지인 ‘네이처 커뮤니케이션즈(Nature Communications)'에 4월 24일 字 온라인 게재됐다.
 ※ 논문명 : Targeted and high-throughput gene knockdown in diverse bacteria using synthetic sRNAs
 ※ 저자 정보 : 이상엽(한국과학기술원, 교신저자), 조재성(한국과학기술원, 현 MIT 박사후연구원, 공동 제1저자), 양동수(한국과학기술원, 현 고려대학교 조교수, 공동 제1저자), Cindy Prabowo (한국과학기술원, 공동저자), Mohammad Ghiffary (한국과학기술원, 공동저자), 한태희 (한국과학기술원, 공동저자), 최경록 (한국과학기술원, 공동저자), 문천우 (한국과학기술원, 공동저자), Hengrui Zhou (한국과학기술원, 공동저자), 류재용 (한국과학기술원, 현 덕성여자대학교 조교수, 공동저자), 김현욱 (한국과학기술원, 공동저자) - 총 11명

sRNA는 대장균에서 표적 유전자를 억제하기 위해 합성 조절하는 효과적인 도구이지만 그동안 대장균과 같은 그람 음성균 외에 산업적으로 유용한 고초균이나 코리네박테리움 같은 그람 양성균에서는 적용이 어려웠다.

이에 KAIST 생명화학공학과 이상엽 특훈교수 연구팀은 그람 음성균과 양성균 모두를 포함한 다양한 박테리아에서 표적 유전자를 효과적으로 억제할 수 있는 신규 sRNA 도구를 개발했다. 연구팀은 우선 미생물 데이터베이스를 이용해 수천 종의 미생물 유래 sRNA 시스템을 검토했고, 그중 가장 높은 유전자 억제능을 보여준 `고초균(Bacillus subtilis)' 박테리아 유래 sRNA 시스템을 최종 선정했고 이를 ’광범위 미생물 적용 sRNA‘(Broad-Host-Range sRNA, 이하 BHR-sRNA)라고 명명했다.

sRNA와 유사한 시스템으로는 유전자 가위로 잘 알려진 크리스퍼(CRISPR)를 개량한 크리스퍼 간섭(CRISPR interference, CRISPRi) 시스템이 있다. 유전자 가위의 핵심인 Cas9 단백질에 돌연변이를 일으켜 DNA를 자르지 않으면서 유전자 전사 과정만을 억제해 유전자 발현을 억제하는 시스템인데, Cas9 단백질의 분자량이 매우 높아 몇몇 박테리아에서 성장을 저해하는 현상이 보고됐다. 하지만 이번 연구에서 개발한 BHR-sRNA 시스템은 박테리아의 성장에 전혀 영향을 끼치지 않으면서도 CRISPR 간섭과 유사한 유전자 억제능을 보였다.

BHR-sRNA 시스템의 범용성을 검증하기 위해 연구팀은 다양한 그람 음성균 및 그람 양성균 16종을 선정하여 테스트했고, 그중 15종의 박테리아에서 BHR-sRNA 시스템이 성공적으로 작동함을 증명했다. 또한, 10종의 박테리아에서 기존의 대장균 기반 sRNA 시스템보다 유전자 억제능이 뛰어남을 증명했다. 이와 같이 BHR-sRNA 시스템은 다양한 박테리아에서 효과적으로 유전자 발현을 억제할 수 있는 범용 도구임을 입증했다.

최근 점차 심각해져 가는 항생제 내성 병원균 문제를 해결하기 위해, 연구팀은 BHR-sRNA를 이용해 독성인자를 생산하는 유전자를 억제하고, 결과적으로 병원성을 억제하고자 했다. 특히 BHR-sRNA를 활용해 병원 발생 감염균인 표피포도상 구균(Staphylococcus epidermidis)에서 항생제 내성의 원인 중 하나인 바이오필름 형성을 73% 억제할 수 있었고, 폐렴균인 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae)에서 항생제 내성을 58% 약화하는 결과를 보였다. 연구팀은 또한, BHR-sRNA를 산업용 박테리아에 적용해 표적 물질을 고효율로 생산하고자 했다. 특히 폴리아마이드 고분자의 원재료인 발레로락탐(valerolactam), 포도향 첨가제인 메틸안트라닐산(methyl anthranilate), 그리고 청색 천연염료인 인디고이딘(indigoidine)을 최고 농도로 생산할 수 있었다.

이번 연구를 통해 개발한 BHR-sRNA를 활용해 다양한 산업공정으로의 응용이 기대되며, 항생제 내성 병원균 퇴치를 통한 연구에도 활용될 수 있으리라 기대된다. 교신저자인 KAIST 이상엽 특훈교수는 “기존에는 각각의 박테리아마다 유전자 억제 도구를 새로 개발해야 했는데, 이번 연구를 통해 다양한 박테리아에서 범용으로 작동하는 도구를 개발했다”며 “앞으로 합성생물학과 대사공학, 그리고 병원균 대응연구 발전에 큰 도움이 될 것”이라고 밝혔다. 

한편, 이번 연구는 과기정통부가 지원하는 석유대체 친환경 화학기술개발사업의 바이오화학산업 선도를 위한 차세대 바이오리파이너리 원천기술 개발 과제의 지원을 받아 수행됐다. 

□ 연구 배경 
  ㅇ 박테리아는 우리 눈에 보이지는 않지만, 일상에서 떼어놓을 수 없을 만큼 밀접한 관계를 맺고 있다. 특히 김치, 된장, 술 등 식품에 활용되어왔을 뿐만 아니라 최근에는 대사 공학을 통해 플라스틱, 영양제, 사료, 의약품 등을 생산하는 산업용 세포 공장으로 활약하고 있다. 하지만 우리 주변에는 이러한 유익한 박테리아 외에도 다양한 감염성 질병을 일으키는 폐렴균, 살모넬라균, 황색포도상구균 등 병원균 또한 함께하고 있다.
  ㅇ 산업용 박테리아의 경우, 복잡한 대사 및 조절 회로를 구성하는 다양한 유전자의 발현을 효과적으로 조작함으로써 생산하고자 하는 물질을 고효율로 생산할 수 있다. 하지만 기존의 염색체 조작 기술은 많은 시간과 노력이 필요하므로, 수많은 유전자 중 어떤 유전자를 억제하는 것이 효과적인지 테스트하기 어려웠다. 또한, 병원성 박테리아의 경우, 병원성을 띠게 하는 독성 유전자를 효과적으로 억제할 수 있다면 병원성을 현저히 약화하거나 병원균을 사멸시킬 수도 있다. 하지만 다양한 박테리아는 서로 다른 생리적 특성이 있으므로 각각의 박테리아에 대하여 유전자 억제 방법을 따로 개발해야 하는 문제가 있다.
  ㅇ 본 연구팀은 기존 연구를 통해 대장균에서의 유전자 억제를 위한 합성 조절 sRNA 전략을 개발한 바 있다. sRNA는 표적 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합함으로써 리보솜의 번역 과정을 막아 표적 유전자의 발현을 효과적으로 억제하는 도구이다. 하지만 sRNA는 그동안 대장균과 같은 그람 음성균 외에 그람 양성균에서는 적용이 어려웠다.

 □ 연구내용
  ㅇ 본 연구팀은 그람 음성균과 양성균 모두를 포함한 다양한 박테리아에서 표적 유전자를 효과적으로 억제할 수 있는 신규 sRNA 도구를 개발하였다. 우선 미생물 데이터베이스를 이용하여 수천 종의 미생물 유래 sRNA 시스템을 살펴본 결과 기능이 검증된 sRNA 시스템 6종을 선별하였다. 선별된 6종의 sRNA 시스템의 각 요소 (sRNA 스캐폴드 및 RNA 샤페론 단백질인 Hfq)를 조합으로 테스트한 결과, Bacillus subtilis 박테리아 유래 RoxS sRNA 스캐폴드 및 Hfq 단백질로 구성된 sRNA 시스템이 그람 양성균에서 가장 높은 유전자 억제능을 보여주었다. 본 연구진은 해당 시스템을 BHR-sRNA(broad-host-range sRNA; 광범위 미생물 적용 sRNA)라 명명하였다.
  ㅇ sRNA와 유사한 시스템으로는 유전자 가위로 잘 알려진 CRISPR를 개량한 CRISPR 간섭 (CRISPR interference, CRISPRi) 시스템이 있다. 유전자 가위의 핵심인 Cas9 단백질에 돌연변이를 일으켜 DNA를 자르지 않으면서 유전자 전사 과정만을 억제하여 유전자 발현을 억제하는 시스템인데, Cas9 단백질의 분자량이 매우 높기 때문에 몇몇 박테리아에서 성장을 저해하는 현상이 보고되었다. 하지만 본 연구에서 개발한 BHR-sRNA 시스템은 박테리아의 성장에 전혀 영향을 끼치지 않으면서도 CRISPR 간섭과 유사한 유전자 억제능을 보여주었다.
  ㅇ BHR-sRNA 시스템의 범용성을 검증하기 위해 다양한 그람 음성균 및 그람 양성균 16종을 선정하여 테스트하였고, 그중 15종의 박테리아에서 BHR-sRNA 시스템이 성공적으로 작동함을 증명하였다. 또한, 10종의 박테리아에서 기존의 대장균 기반 sRNA 시스템보다 유전자 억제능이 뛰어남을 증명하였다. 이와 같이 BHR-sRNA 시스템은 다양한 박테리아에서 효과적으로 유전자 발현을 억제할 수 있는 범용 도구임을 입증하였다.
  ㅇ 최근 점차 심각해져 가는 항생제 내성 병원균 문제를 해결하기 위해, BHR-sRNA를 이용하여 독성인자를 생산하는 유전자를 억제하여 병원성을 억제하고자 하였다. 우선 병원 기반 감염을 일으키는 대표적 그람 양성 병원균인 Staphylococcus epidermidis에서 항생제 내성의 원인 중 하나인 바이오필름 형성에 관여하는 유전자를 BHR-sRNA로 억제한 결과, 바이오필름 생산이 73% 감소함을 확인하였다. 또한, 폐렴 및 패혈증 등을 일으키는 대표적 그람 음성 병원균인 Klebsiella pneumoniae에서 항생제 내성에 관여하는 유전자를 억제한 결과, 항생제 처리 시 균주 사멸 비율이 58% 증가함을 보여주었다.
  ㅇ BHR-sRNA를 산업용 박테리아에 적용하여 표적 물질을 고효율로 생산하고자 하였다. 우선 폴리아마이드 고분자의 원재료인 발레로락탐 (valerolactam) 생산을 증가시키고자 주요 유전자들을 BHR-sRNA를 활용하여 억제하였고, 그 결과 포도당으로부터 발레로락탐을 세계 최고 농도로 생산할 수 있었다. 동일한 전략을 활용하여 포도향 첨가제인 메틸안트라닐산 (methyl anthranilate) 또한 포도당으로부터 고효율로 생산할 수 있었다. 또한, MSG 생산으로 유명한 대표 산업 박테리아인 코리네박테리움 내 2959개 유전자 억제를 위한 sRNA 라이브러리를 제작하였다. 이를 청색 염료인 인디고이딘 (indigoidine) 생산에 적용하여 세계 최고 농도로 생산할 수 있었다.
  ㅇ 본 연구를 통해 개발한 BHR-sRNA를 활용하면 앞으로 인공육, 제트 연료, 건강보조물질, 의약품, 플라스틱 등 고부가가치 화합물 및 재료를 생산할 수 있는 바이오 공정 상용화를 앞당길 수 있으리라 기대된다. 그뿐만 아니라, 항생제 내성 병원균 퇴치에도 적용되어 앞으로 다가올 또 다른 판데믹 대비에도 활용될 수 있으리라 전망한다.
 

[그림 1] 다양한 박테리아의 유전자 억제를 위한 sRNA 도구 개발 
(A) 합성 조절 sRNA 작동 체제 모식도. (B) 본 연구를 통해 개발한 BHR-sRNA의 작동이 입증된 16종의 다양한 박테리아를 나타낸 계통수 (phylogenetic tree).