국내연구진이, 기존 CRISPR-Cas12a 유전자 가위가 표적을 선택적으로 인식하는 성질(표적 특이성)을 극대화 할 수 있는 기술을 개발하였다. 향후 특정 변이 유전자로 인해 발생하는 희귀성 난치 질환 및 유전 질환 치료제 개발에 큰 기여를 할 것으로 기대된다.

한국생명공학연구원(이하 생명연) 국가영장류센터 이승환 박사팀, 미래형동물자원센터 김선욱 박사팀(교신저자: 이승환/김선욱 박사, 공동 제1저자: 김한섭 박사과정, 이위재 석사과정 학생)과 경북대학교 이동석 교수팀(교신저자: 이동석 교수)이 수행한 이번 연구는 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 신진연구자지원사업과 국가과학기술연구회가 진행하는 BIG(Big Issue Group) 사업 지원으로 수행되었고,  ‘핵산 연구(Nucleic Acids Research, IF 11.501)’ 7월 20일자(한국시각 7월 21일) 온라인 판에 게재되었다.
     (논문명 : Enhancement of target specificity of CRISPR–Cas12a by using a chimeric DNA–RNA guide)
 

한국생명공학연구원 이승환, 김선욱, 경북대학교 이동석

유전자가위로도 불리는 CRISPR-Cas12a 시스템은 박테리아, 고세균에서 발견되는 면역체계의 일종이며, 표적 DNA에 결합하여 이중 나선 절단을 유도한다고 알려져 있으며, 생명체 유전체 교정에 보편적으로 사용되고 있다.

CRISPR-Cas12a 유전자 가위는 CRISPR-Cas9 과는 다른 종류의 염기서열을 인식하여 CRISPR-Cas9 유전자 가위와 상보적으로 사용되고 있으나, 특정 유전자를 의도치 않게 절단하는 문제로 인해 유전자 치료제로서 인체 적용 시 보완해야할 점으로 비표적 절단 이슈가 지적되고 있었다.

본 연구팀은 CRISPR-Cas12a 유전자 가위에 대하여 표적 특이성을 향상시키기 위해 CRISPR-Cas12a 구성물중 특정 염기서열 말단을 DNA로 치환하여 비표적 절단을 획기적으로 줄이는 방법을 개발하였다.

연구팀은 실험을 통해 CRISPR-Cas12a 구성물 중 특정 염기서열 말단을 DNA로 치환시킨 CRISPR-Cas12a 유전자 가위 사용 시, 다양한 유전자 타겟에서 표적 특이성이 크게 증가함을 확인하였다.

연구책임자인 이승환 박사는 “동 연구성과는 유전자 가위의 표적 특이성이 CRISPR 유전자 가위 구성물의 특정 염기서열의 말단을 DNA로 치환하는 방법을 통해 혁신적으로 증가될 수 있다는 사실을 밝힌 것”이라며,

 “본 연구에서 개발된 방법은 가이드 RNA를 근간으로 작동하는 다양한 유전자 가위 시스템에 적용될 수 있고, 효율적 암 치료제뿐만 아니라 다양한 유전 질환, 희귀성 난치 질환 등의 유전자 치료제 개발에 있어서 안전성 향상 면에서 큰 기여를 할 것으로 기대된다”고 밝혔다.

연   구   결   과   개   요

□ 연구배경
○ 현재 상용되는 제3세대 표적 특이적 유전자 가위인 크리스퍼(CRISPR) 시스템은 Cas단백질과 RNA 핵산 기반의 가이드 중합체로 작동하여, 제작이 용이하고 저렴하기 때문에 차세대 유전자 치료제로써 널리 각광받고 있음.
○ CRISPR-Cas 유전자 가위 시스템은 표적 DNA에 상보적 염기서열을 가진 RNA 핵산 기반의 가이드를 이용하여 표적 DNA 염기서열을 인식하고, 활성화된 도메인을 이용하여 표적 DNA에 이중 나선 절단을 유도함.
○ CRISPR-Cas 유전자 가위중 티민(T)이 많은 표적에 범용적으로 사용되는 CRISPR-Cas12a 시스템 역시 RNA 가이드를 기반으로 작동하고, 표적 염기서열 이외 비슷한 여러 비표적 절단이 많은 성질로 인하여 인체 대상 유전자 치료제로써 문제점을 내포하고 있는 상태임.
    * 가이드 RNA : CRISPR-Cas 시스템이 유전체 교정을 위해, 표적 DNA 염기서열 인식을 유도하는 RNA 구조체

○ 따라서 이러한 유전자 가위들의 표적 절단 효율을 유지하면서, 비표적 절단을 줄여 표적 특이성을 향상시키는 일이 향후 인체 적용 시 매우 중요한 사안으로 부각되고 있음.  
    * 표적 특이성: 표적 DNA 유전자 교정시, CRISPR-Cas 시스템의 가이드 RNA를 이용한 타겟 인식에서 비표적 대비 표적 절단 효율을 나타냄. 비표적 절단이 적은 CRISPR-Cas 시스템이 높은 표적 특이성을 갖게 되어 인체 적용시 안전성이 높아짐.

□ 연구내용
○ 연구팀은 최근 유전체 교정 및 제어에 범용적으로 사용되는 CRISPR-Cas12a 유전자 가위에 대하여 가이드 RNA 3‘ 말단의 DNA 치환시 표적 특이성이 증가할 수 있음을 규명하였다.
○ 이 연구에서 연구팀은 가이드 RNA 염기서열 3’ 말단을 DNA로 치환하여 가이드와 표적 DNA간의 결합 에너지에 변화를 주어 비표적 절단을 현저히 줄일 수 있었다.  
○ CRISPR-Cas12a 유전자 가위에 가이드 RNA 3‘ 말단의 DNA 치환시, 표적 유전자의 타겟 DNA 이중나선 중 단일가닥과 정상적으로 결합하여 이중 나선 절단을 유도하지만, DNA 치환된 가이드 RNA가 비표적 DNA에 결합시에는  불안정한 구조를 초래하게 되어 비표적 DNA 절단이 줄어들게 된다.  
○ 즉, 본 연구의 성과는 CRISPR-Cas12a 유전자 가위에 대하여 가이드 RNA 3‘ 말단을 DNA로 치환하여 표적 DNA 절단은 유지시키고, 비표적 DNA 절단은　상대적으로 줄일 수 있음을 규명한 것이다. 그 결과 CRISPR-Cas12a 유전자 가위의 표적 특이성을 획기적으로 증진 시킬 수 있었고, 유전자 변이에 기인한 다양한 인체 질병 치료제 개발의 가능성을 제시하고 있다.

□ 연구성과의 의미
▶ CRISPR-Cas12a의 가이드 RNA 개량을 이용한 표적 특이성이 증가된 정교한 유전체 교정 기술 개발: 다양한 유전자 변이에 의해서 발생한 질병의 치료제 개발 및 원천기술 연구 활용
○ 본 연구의 가이드 RNA 개량을 통한 표적 특이성이 향상된 CRISPR-Cas12a 유전자 가위 개발은 특정 유전자의 변이에 의해 생긴 다양한 유전 질병의 효율적인 치료제 개발에 큰 기여를 할 것으로 기대된다. 특히 현재 치료제가 없는 희귀성 난치질환 등에 유전자 치료를 통하여 원천적인 접근이 필요한 경우 본 개발은 안전성 면에서 파급효과가 클 것으로 사료된다.
○ 또한, CRISPR-Cas12a 유전자 가위의 안전성 증진을 기반으로 다른 범용 유전자 가위에도 본 기술의 원리가 적용될 수 있을 것으로 예상된다.

연 구 결 과  문 답

이번 성과 뭐가 다른가

기존에 범용적으로 사용되던 유전자 가위 CRISPR-Cas12a 에 대하여 가이드 RNA를 개량하여 표적 특이성을 향상시킴.

어디에 쓸 수 있나

1. 암 등 다양한 유전자 변이에 의해서 생기는 유전 질환 치료를 위한 인체 대상 안전한 표적치료제 개발. 의료산업에 파급효과 큼.
2. 동/식물, 미생물등 다양한 생체내에서 유전자를 안전하게 조절하거나 제어 가능. 바이오 산업에 파급효과 큼.

실용화까지 필요한 시간은

본 연구결과는 기존 유전자 가위에 대해 표적 특이성 향상 방법을 제시하는 기초연구로서, 인체대상 효율적인 유전자 가위 전달 방법 개발 및 임상 단계의 시도와 속도에 따라 실용화 소요시간이 결정될 것.

실용화를 위한 과제는

현재 개발된 유전자 가위 기법을 인체에 직접 적용하기 위해 특정 장기나 목적하는 부위로 정확히 전달하는 방법이 개발되어야 함. 그 이외 인체내 주입시 면역반응 여부와 인체내 작동시 유효성을 증진시키는 방법이 병행되어야 함.

연구를 시작한 계기는

현재 범용적으로 사용하는 유전자 가위 CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12a에 대해서 전장 유전체 수준, 비표적 절단 여부를 테스트 하였을 때, 비표적 절단 이슈가 유전체 교정 관련해서 큰 문제로 남아있는 상황임. 향후 인체내 치료제로 적용시 가장 중요한 문제는 안전성이라는 점에서 본 유전자 가위의 개량을 시작하게 됨.

에피소드가 있다면

본 연구에서 CRISPR-Cas12a에 대해서 가이드 RNA를 개량하여 표적 특이성을 높이는 과정에서 시험관내 결과와는 달리 생체내 염색체상의 유전자를 타겟하는 생체 실험에서는 비표적/표적 모두에 대해서 활성이 크게 떨어지는 결과를 발견하였다. 이를 극복하기 위해 세포내 응축된 염색체상에서 타겟을 노출시킬 수 있는 방법을 병행하였고, 이에 따라 극적으로 표적 타겟팅은 증가시키고 비표적 타겟팅은 줄여 표적 특이성을 극대화 시킬 수 있었음.

꼭 이루고 싶은 목표는

현재 CRISPR-Cas12a에 대해서 가이드 RNA의 부분적인 DNA 치환을 통하여 표적 특이성을 향상시켰으나, 전체적으로 개량된 가이드를 이용하여 작동시킬 수 있으면 표적 특이성이 더 증가 될 것임. 이후 전임상 테스트도 진행하여 임상으로 적용 가능한 유전자 치료제를 개발할 목표를 가지고 있음.  

신진연구자를 위한 한마디

본 연구 과정에서 결과가 생각한 가설과 다르게 나온 상황에서  여러 방향으로 방법을 모색하여 표적 특이성이 증대된 유전자 가위 기술을 개발하였을 때 값진 희열을 느꼈음. 처음 연구하시는 연구자 분들도 실험 과정 중 당연히 생기는 난관을 어려워만 하지 말고, 재미있게 퍼즐을 맞추듯이 다각도로 생각해보면, 분명 즐거운 결과를 얻을 수 있을 것임. 꼭 내가 생각했던 가설이 정답은 아니라는 마인드를 가지는 것이 중요하다고 생각함.