순수 국내연구진이 인간 전분화능 줄기세포*를 이용하여 증식 가능한 3차원 형태의 인간 간 모사모델을 개발하는데 성공하였다. 신약개발 단계에서 필수적인 간독성, 유효성 평가용 인체모사 간 모델로, 동물실험과 임상시험 간극을 메우는데 활용도가 높을 것으로 기대된다.
     * 인간 전분화능 줄기세포: 인체의 거의 모든 신체세포로 분화가 가능한 줄기세포로서, 배아줄기세포 및 역분화 줄기세포/유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs, 완전히 분화가 끝난 체세포를 배아줄기세포 상태로 역분화 시킨 세포, Shinya Yamanaka가 2012년 노벨상 수상)가 전분화능 줄기세포에 해당하며, 특정 세포로만 분화 가능한 성체 줄기세포와 구별된다.

한국생명공학연구원(원장 김장성, 이하 생명연) 줄기세포융합연구센터 손명진 박사팀(교신저자: 손명진/정경숙 박사, 제1저자: 문선주 UST통합과정3년차)이 수행한 이번 연구는 생명연의 Big Issue Group (BIG) 사업, 과학기술정보통신부와 한국연구재단의 중견연구자지원사업, Korea Bio Grand Challenge 사업 및 보건복지부의 질환극복 기술개발 사업의 지원으로 수행되었고, 간 연구분야의 세계적 전문지인 저널오브헤파톨로지(Journal of Hepatology, IF 18.946) 7월 9일자 온라인 판에 게재되었다.
     (논문명 : Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids)

간은 재생이 잘 되는 장기이긴 하지만, 신약개발 단계에서 활용하기 위하여 간 조직을 얻는 것이 쉽지 않을 뿐 아니라, 체외에서 간 세포는 전혀 증식하지 않는 한계를 가지고 있어, 전 세계적으로 이를 극복하기 위한 기술개발이 진행 되어왔다.

특히, 줄기세포를 이용한 간 세포모델 개발의 대표적 두 선두그룹[Hans Clevers(네덜란드), Hideki Taniguchi(일본)]이 있으나, Clevers 그룹은 외과적 수술을 통해 간 조직을 확보해야 하는 한계가 있고, 성체줄기세포 기반이기 때문에 특정 세포만 얻을 수 있는 단점이 있다. Taniguchi 그룹은 본 연구팀과 같은 인간 전분화능 줄기세포를 활용하여 조직의 다양한 세포(혈관, 면역세포 등)를 제공할 수 있는 장점이 있으나, 제작된 간 모델은 오가노이드 형태가 아닌 세포 덩어리 형태이며, 특히 증식하지 않고 기능적으로 미성숙한(실제 간세포와 유사하지 않은) 한계가 있었다.

본 연구팀은 두 기술의 장점을 접목하여, 환자맞춤형의 인간 전분화능 줄기세포를 이용하면서, 3차원 오가노이드* 형태의 간세포 모델로 분화시키는 기술을 완성하였다.
     * 오가노이드: 줄기세포의 자가조직화(Self-organization) 능력을 이용하여 인체 조직과 유사하게 3D 형태로 제작한 장기유사체(입체적 세포배양)

이번 연구성과는, 기존 전분화능 줄기세포 기반 오가노이드 모델이 가지는 한계(증식하지 않고 기능적으로 미성숙)를 극복한 최초의 성과로, 체외에서 장기간 증식이 가능하고, 동결·해동이 가능하며, 기능적으로 성숙한 간 모델을 개발하는데 성공하였다.
 ㅇ 또한, 오가노이드가 성숙화 될수록 인체와 유사한 약물반응을 분석할 수 있어, 보다 정확한 간독성 평가가 가능함을 확인하였고, 지방간(fatty liver) 모델을 제작하고 치료제 발굴을 수행하여, 정상 및 간 질환 플랫폼 활용이 가능함을 입증하였다.

연구책임자인 손명진 박사는 “동물실험에서 간독성이 없었으나 임상에서 독성을 나타내어 심각한 경우 환자가 사망하고, 막대한 비용을 들여 개발한 약물이 퇴출되는 경우가 발생하는데, 결국 신약개발의 효율성을 높이기 위해서는 ‘간 장기유사체’를 얼마나 인간과 유사한 정도로 구현(성숙화)하고, 대량으로 제공 할 수 있는가‘가 관건이다.”며 “본 모델과 같이 인체 유사도가 높은 간 모델을 비임상에 활용함으로써, 향후 신약개발 효율성 향상에 기여할 것으로 기대된다.”고 밝혔다.

연   구   결   과   개   요

□ 연구배경
○ 지난 25년간 비임상을 통과한 약물들이 시장에서 퇴출되는 비율이 20% 이상이고, 간독성이 그 주요 원인 중 하나로, 신약개발 초기 단계에서 정확한 간독성·유효성 예측이 가능한 평가 모델이 반드시 필요하다.    
○ 인간 간에서 직접 분리한 일차배양 간세포가 약물대사능 등의 생체유사도가 높아 현재까지 표준모델(Gold Standard)로 사용되고 있으나, 인간 간 조직 수급이 제한적이고, 특히 체외에서 전혀 증식하지 않는 한계가 있다.
○ 또한, 현재 사용되고 있는 2D 세포기반 모델(평면적 세포배양)은 조직의 복합성 및 생체 반응을 구현하지 못하고, 동물모델은 종(species)차에 의한 인체 반응 예측에 한계가 있어 새로운 인체 모사 모델이 요구되어 왔다.
○ 간 질환연구에 있어서도, 동물모델을 이용한 치료제 개발 연구가 장기간 수행되어 왔으나 임상에서 효과적인 치료제가 사실상 부재하고, 동물실험 반대 여론 및 규제 또한 강화되고 있어, 동물실험을 보완할 수 있는 인간 세포/조직 기반 모델이 요구되고 있는 실정이다.
○ 오가노이드는 배아줄기세포가 인간 개체로 발생되는 과정을 시험관 내에서 모사하여 제작하는 미니 장기유사체로, 개인맞춤 모델제작이 가능하고, 조직 내 주요 세포들의 상호작용 및 발생 단계/질환 진행 과정의 복합성 모사가 가능한 생체유사도가 높은 3D 모델이다.
○ 그러나, 대부분의 줄기세포 기반 오가노이드는 현재 임신 2-3기 태아 수준의 미성숙 상태로, 오가노이드를 성숙화 시키는 기술 개발이 요구되고 있다. 즉, 인체모사 간 모델에 요구되는 핵심 기술은, 대량으로 정확한 약물반응 예측이 가능한가, 즉 “증식 가능”하고 “기능적으로 성숙화” 되어 있는가이다. 즉, 개인맞춤 약물 반응 실험이 가능한 정도의 간세포가 필요하나, 기존 연구에서는 증식이 불가능하여 이러한 약물반응 실험을 수행하기 어려운 측면이 있었다.

□ 연구내용
○ 연구팀은 3차원 오가노이드 배양기술을 이용하여 인간 전분화능 줄기세포로부터 증식 가능하고 기능적으로 성숙한 인체모사 간 모델을 제작하는데 성공하였다.
○ 본 연구팀이 제작한 간 오가노이드는 체외에서 5개월 이상 증식이 가능하며, 동결 보존 이후에도 약물에 대한 반응이 효과적으로 나타난다. 특히 성인의 간 조직 세포를 직접 분리하여 제작한 오가노이드와 비교하여도, 간세포 마커 발현이나 알부민 분비, 세포 호흡 기능 등이 뛰어남을 확인하였다.
○ 또한, 간의 주요 기능인 글라이코겐 합성, 다양한 효소 활성, 우레아 및 담즙 분비능 등이 뛰어나며, 외인성 약물을 대사하여 분해시키는 활성 또한 우수함을 검증하였다.
○ 특히, 2차원 모델에서는 구현하기 힘든 담세관(bile canaliculi) 형성 등 구조적 성숙화 또한 관찰 되었고, 기존 2차원 모델을 사용한 비임상 평가에서는 독성을 나타내지 않아 신약으로 출시되었으나, 시장에서 환자의 사망 사고를 일으킨 당뇨치료제와 항생제를 예시 약물로 사용하여, 본 오가노이드 모델에서는 인체 허용량 이하의 농도에서도 독성을 검출할 수 있음을 확인하였다.
○ 즉, 약물에 대한 독성 민감도가 뛰어난 간독성 예측 모델로써의 우수성을 확인하였고, 약물에 의한 간 세포 손상 후 재생 기능 또한 추적 가능한 모델임을 제시하였다. 
○ 또한, 지방 및 글루코즈 대사 효능이 뛰어나, 외부에서 지방산을 다량 처리하여 손쉽게 지방간 모사모델을 제작할 수 있으며, 이를 이용한 치료제 스크리닝을 수행하였다. 그 중 가장 효과가 뛰어난 두 가지 약물은 이미 지방간 억제 효능이 보고되어 있는 약물로, 본 연구팀이 제작한 질환모델의 신뢰도 및 활용도를 검증하였다.    

□ 연구성과의 의미
▶ 인체모사 간 모델 제공 : 간독성 평가 및 간질환 치료제 개발에 활용
○ 인체와 보다 유사한 환자맞춤형의 인체모사 간 모델을 제공함으로써, 대량으로 정확한 약물반응 예측을 가능하게하고 신약의 부작용을 줄임으로써 개인맞춤 신약개발을 앞당기는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
○ 특히 본 연구팀이 개발한 간 오가노이드 기술은 논문에 제시된 간 장기유사체 모델 조성과 방법에 따라 누구나 손쉽게 재현 가능한 모델로, 생체모사 신약개발 플랫폼 제작의 수월성을 확보한데 또 다른 의미가 있다.
○ 또한, 발생 단계 및 질환 진행 과정, 조직 재생 과정의 이해 등을 통한 관련분야 원천기술 연구 및 치료제 개발 연구에도 활용가치가 클 것으로 예상된다.

연 구 결 과  문 답

이번 성과 뭐가 다른가

증식하지 않는 분화된 간세포를 3차원 오가노이드 기술을 이용하여 장기간 배양 가능하고, 기능적으로 성숙한 모델로 완성하였음

어디에 쓸 수 있나

· 개인맞춤 간독성 평가 모델
· 환자맞춤 간 질환모델 제작, 개인맞춤 약효 평가
· 발생, 조직 재생, 질환 진행과정 및 치료제 개발 연구에 활용

실용화까지 필요한 시간은

본 연구결과는 인체 장기를 모사할 수 있는 조직을 개발하는 기초연구의 시작으로, 조직 내 세포 복합성, 구조모사 등 간 조직모사를 위한 기술개발의 속도에 따라 실용화 소요시간이 결정될 것

실용화를 위한 과제는

본 연구팀이 개발한 오가노이드는 기존 사용되고 있는 2D 세포주 모델 대비, 인체유사도는 현저히 높으나 보다 고차원의 간 조직의 복합성 모사가 요구되며, 제작 방법에 있어 고가의 배양인자 사용으로 기존 세포주 모델 대비 경제성이 떨어지기 때문에 이를 보완하기 위한 기술개발 또한 필요함

연구를 시작한 계기는

생명연 Big Issue Group (BIG) 사업은 동물실험을 보완할 수 있는 인간 세포 기반의 생체모사 인공실험체를 개발하는 것을 목표로, 약물의 흡수(장), 대사(간), 배출(신장) 등의 평가가 가능한 인체모사 모델을 개발하고 있음. 그 중 본 연구팀이 대사를 담당하는 간 오가노이드 연구를 3년간 수행하여 인체모사 간 모델을 개발하였음

에피소드가 있다면

연구초기에 기존 방법을 따라 2D 간 세포분화를 수행하던 중, 3D 형태의 오가노이드가 생성되는 것을 우연히 관찰하였고, 원내 줄기세포 전문가들의 도움으로 새로운 형태의 간 오가노이드 개발 기술을 완성할 수 있었음

꼭 이루고 싶은 목표는

“증식하지 않고 기능적으로 미성숙한” 간 세포모델의 한계를 한 단계 넘어서긴 했지만, 현재 개발된 오가노이드는 유전자 발현 수준에서 인간 간과의 유사도가 60% 수준으로, 인체 유사도와 기능을 보다 강화하여, 이후 실제 비임상에서 표준으로 활용될 수 있는 모델이 되도록 기술을 완성해 나가고자함

신진연구자를 위한 한마디

연구결과에서 사소한 차이를 인지할 수 있는 직관, 관찰력을 키우고, 전문가, 동료와의 협업을 통한 문제해결·융합 연구능력을 확대해 나가는 것이 중요함. 창의적인 신진연구자들과 다양하고 자유로운 연구 문화를 함께 만들어 가길 기대함.

그림 1. 간 오가노이드 제작 및 활용 모식도
인간 피부세포(fibroblasts)를 전분화능 줄기세포(iPSCs)로 리프로그래밍 시킨 후, 3차원 오가노이드 형태의  간 장기모사체(human hepatic organoid)로 제작. 증식(self-renewal) 가능하고  고기능(functional)으로 정상 및 간 질환을 모델링(disease modeling)하여 개인맞춤 독성 및 약효 평가(personalized drug toxicity and efficacy screening)에 활용 가능함.

그림 2. 간 오가노이드 제작 모식도 및 대표사진
(A)제작단계 모식도, (B-D)오가노이드 대표사진, (E)오가노이드 증식능 (F)대표마커 발현.

그림 3. 간 오가노이드를 활용한 간 독성평가 민감도 검증.
(A-B)약물대사 효소 발현 및 활성검증, (C-H)간 독성평가 민감도 검증.

그림 4. 지방간 오가노이드 모델제작 및 치료제 발굴.
(A)지방대사 유전자 발현의 증가, (B-D)지방간 모델 제작 및 검증, (E-G)지방간 치료제 발굴 및 검증.