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뉴스 생명과학
단백질 낚시법’으로 고순도‧고효율 단백질 정제
Bio통신원(기초과학연구원)
암과 같은 질병은 체내 단백질이 변형을 일으켜 생긴다. 질병을 치료하기 위한 원리와 발병 기작을 규명하기 위해서는 세포 내 존재하는 수많은 단백질 중 약물과 상호작용하는 특정 단백질을 선택적으로 얻는 과정이 필수적이다. 기존 단백질 정제법은 반응에 첨가되는 다량의 첨가물이 단백질 변성을 일으키거나 얻으려는 단백질 외 다른 단백질까지 추출되어 결과적으로 질병 진단과 치료의 정확도가 떨어지는 한계가 존재했다.
기초과학연구원(IBS) 복잡계 자기조립 연구단(단장 김기문)은 분자 바구니 ‘쿠커비투릴(Cucurbit[n]urils)’을 이용해 특정 단백질만 고순도, 고효율로 얻을 수 있는 정제법을 개발했다. 기존 단백질 정제법 대비 이종 생물질 오염이 적고 제조, 사용, 보관이 용이하며 저렴하다. 향후 질병 기작 파악, 신약 개발, 약물 부작용 기전 연구에 유용하게 활용될 것으로 기대된다.
연구진이 활용한 쿠커비투릴은 속이 빈 호박 모양을 한 분자다. 쿠커비투릴은 작은 분자를 담을 수 있는 바구니 역할을 하는데, 화합물인 페로센 등 자기와 꼭 맞는 짝을 찾아 결합하는 특징을 갖고 있다. 연구진은 이러한 쿠커비투릴의 특징을 활용하여 미끼로 유인해 물고기를 잡는 낚시처럼 미끼 물질을 통해 특정 단백질을 얻는 ‘단백질 낚시법’을 새롭게 개발했다.
암의 일종인 피부T세포 림프종을 치료하는데 사용되는 사하(SAHA, Suberanilo-hydroxamic acid-ammonium-adamatane) 약물은 탈아세틸화효소에 선택적으로 상호작용해 병을 치료한다. 하지만, 아직도 이 약물의 작용 기작은 명확히 알려져 있지 않다. 연구진은 변형된 사하(SAHA) 약물을 탈아세틸화효소에 대한 미끼로 사용했다. 사하 미끼가 탈아세틸화효소와 결합하면 낚시 도구인 쿠커비투릴 수용체가 다시 이들과 결합하여 탈아세틸화효소를 농축한다. 이후 쿠커비투릴과 보다 강하게 결합하는 페로센 변형 화합물이 미끼인 사하 약물과 치환되면서 탈아세틸화효소만 남아 추출이 가능해지는 것이다(그림 1 참조). 이로써 초분자화학을 기반으로 탈아세틸화효소만 선택적으로 분리할 수 있음을 보였다. 또한 살아있는 세포 내에서도 모든 과정이 가능함을 증명했다.
김기문 단장은 “단백질 낚시법으로 사하 외 다른 약물을 분자 미끼로 이용한다면, 암을 비롯한 다양한 질병에 관여하는 단백질을 선택적으로 분리하고 분석할 수 있을 것이다”고 연구의 의의를 밝혔다. 또한 “단백질 낚시법은 기존의 주된 단백질 정제법과도 상호보완적으로 적용이 가능해 약물의 부작용을 낮추고, 신약을 개발하는 연구에 유용할 것으로 기대된다”고 밝혔다.
이번 연구결과는 안게반테 케미(Angewandte Chemie International Edition, IF 11.709) 2월 1일자 온라인판에 ‘주목할 만한 논문(hot paper)’으로 선정되었으며 2월 20일 논문으로 출판되었다.
논문명
Enrichment of Specifically Labeled Proteins by an Immobilized Host Molecule
/Angewandte Chemie International Edition
저자정보
James Murray, Jaehwan Sim, Kyunghoon Oh, Gihyun Sung, Ara Lee, Annadka Shrinidhi, Ayyavu Thirunarayanan, Dinesh Shetty*, Kimoon Kim*
연구내용
보충설명
■ 초분자화학: 수소결합, 정전기 상호작용, 소수성 결합 등 분자 사이에서 작용하는 약한 힘 및 이를 이용한 나노 구조체 형성에 대해 연구하는 화학의 한 분야이다. 이를 바탕으로 카테네인, 로탁세인 등 위상학적으로 흥미로운 구조체들이 합성되었으며, 이를 설계하고 합성한 공로로 장 피에르 소바주(Jean-Pierre Sauvage), 프레이저 스토다트(Sir J. Fraser Stoddart), 베르나르트 페링하(Bernard L. Feringa)가 2016년 노벨화학상을 수상했다.
■ 클릭 반응: 아지드와 알카인의 반응으로 트리졸이 형성되며 두 분자가 연결되는 반응을 칭한다. 클릭 반응은 다른 유기화학적 반응과 달리 물에서도 잘 일어나며, 빠르고 높은 수율을 보이는 특징을 갖는다. 이러한 특징 때문에 특정 생체분자를 표지 및 탐지, 정량하는데 널리 쓰인다.
■ 바이오틴-스트렙타아비딘 결합쌍(Bt-SA): 자연계에서 가장 강력한 상호작용을 한다고 알려진 결합쌍이다. 분자생물학 및 생명공학 분야에서 이를 바탕으로 한 단백질 표지 및 분리법이 개발되어 널리 쓰이고 있다.
■ 쿠커비투릴-손님분자 인공 분자 결합쌍: 쿠커비투릴은 속이 빈 호박 모양을 하고 있는 나노사이즈의 화합물로써, 페로센 혹은 아다만탄아민이라 불리는 화합물과 강력한 비공유 결합을 한다. 이 때, 쿠커비투릴을 주인분자, 페로센 혹은 아다만탄아민을 손님분자에 빗대어 이 비공유 결합을 주인-손님 상호작용이라 한다. 이 쿠커비투릴 기반의 주인-손님 상호작용은 자연계에서 가장 강한 비공유 결합쌍인 바이오틴-스트렙타아비딘 결합력 이상임을 복잡계 자기조립 연구단에서 밝혀낸 바 있으며, 이러한 특징을 이용한 다양한 응용연구를 진행중이다.
기타사항
[연구 배경] 기존의 단백질 표지 및 분리, 분석에 이용되던 방법인 클릭 반응 및 바이오틴-스트렙타아비딘 결합쌍은 많은 문제점이 있었다. 클릭 반응의 경우, 반응을 위해 첨가되는 많은 양의 구리염, 환원제 등이 분석하고자 하는 단백질을 변성시키는 문제점이 있었으며, 바이오틴-스트렙타아비딘 결합쌍의 경우 세포 스스로 바이오틴 표지를 해 놓은 다른 단백질들 까지 정제되어 거짓양성의 결과를 나타낸다는 문제점이 있었다.
2011년 우리 연구단에서는 단백질의 분리 정제에 이용되던 기존의 바이오틴-스트렙타아비딘 결합쌍을 초분자 화학을 기반으로 작용하는 강력한 인공 주인-손님 상호작용쌍인 쿠커비투릴-페로센 화합물 결합쌍으로 대체해 낮은 생물질 오염과 높은 정제효율을 가지는 세포 표면 단백질 낚시법으로 사용할 수 있음을 보고 했다. 본 연구는 이러한 연구를 기반으로 세포내에서 생물학적으로 중요한 역할을 하는 단백질로 암 등과 같은 질병 기작과 밀접한 관계를 가진 단백질인 히스톤 탈아세틸화 효소를 정제하고자 하였다.
[연구 과정] 히스톤 탈아세틸화 효소를 선택적으로 정제하기 위해 우리는 분자 미끼를 이용하는 전략을 선택했다. 히스톤 탈아세틸화 효소와 결합하는 분자로 피부 T세포 림프종의 약물로 사용되는 사하(SAHA)를 이용하였다. 이 분자를 바탕으로 히스톤 탈아세틸화 효소를 선택적으로 표지할 수 있는 새로운 분자 미끼를 디자인 및 합성하였고, 이를 이용하여 세포용해액과 살아있는 투과성 세포에서 히스톤 탈아세틸화 효소를 정제했다.
[어려웠던 점] 초기에 히스톤 탈아세틸화 효소를 선택적으로 표지하는 새로운 분자 미끼를 디자인 한 후 세포용해액으로 히스톤 탈아세틸화 효소를 정제하고자 하였지만 계속 실패하였다. 이를 히스톤 탈아세틸화 효소와 사하 약물의 비공유적 상호작용이 약하기 때문이라고 추정하였고, 이를 극복하기 위해 자외선을 쬐어주면 영구적으로 공유결합을 형성 할 수 있는 작용기를 포함하는 새로운 분자 미끼를 디자인 및 합성하였다. 그 결과, 분리하지 못했던 히스톤 탈아세틸화 효소를 성공적으로 정제할 수 있었다.
[성과 차별점] 이번 연구를 통해 초분자화학을 바탕으로 하여 특정 단백질만을 선택적으로 분리할 수 있음을 보여주었다. 이를 통해 기존의 단백질 정제법에서 쓰이는 클릭 반응 및 바이오틴-스트렙타아비딘 결합의 단점을 극복할 수 있었다. 또한, 사하 이외에 다른 약물을 분자 미끼로 이용한다면, 암을 비롯한 다른 질병에 관여하는 단백질을 선택적으로 분리 및 분석할 수 있다. 이를 통해 약물의 부작용을 경감하며 신약을 개발하는 연구 분야에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대한다.
[향후 연구계획] 본 연구단이 개발한 쿠커비투릴-페로센 결합쌍 단백질 낚시법은 기존의 바이오틴-스트렙타아비딘 결합쌍을 이용한 단백질 낚시법과 상호 방해하지 않는 특징을 가지고 있다. 이러한 특징을 이용하여 두 결합쌍을 동시에 이용하여 서로 다른 두 단백질을 동시에 정제하고 분석함으로, 단백질간의 상호작용에 대한 연구가 가능할 것으로 예상한다.
※ 이번 연구는 기초과학연구원(IBS-R007-D1)을 통해 수행되었다.
그림. 1 초분자화학을 기반으로 한 질병 단백질 낚시법 개요도
연구진은 속이 빈 호박 모양의 쿠커비투릴 분자를 낚시 도구로 사용해 특정 단백질을 정제해내는 단백질 정제법을 개발했다. 사하 약물을 변형해 만든 분자 미끼로 주요 약물표적으로 주목받고 있는 탈아세틸화효소를 선택적으로 분리하는 데 성공했다. 먼저 사하 약물을 변형시켜 만든 미끼를 세포에 침투시켜 미끼가 탈아세틸화 효소와 결합하도록 만든다. 이후 결합을 강화시키기 위해 자외선을 쬐고 낚시 도구 역할을 하는 쿠커비투릴 수용체가 이들과 다시 결합하게 한다. 탈아세틸화효소가 농축되면 사하 미끼를 쿠커비투릴과 보다 더 강한 결합을 하는 페로센과 치환하여 탈아세틸화효소를 분리해낸다.
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