한국연구재단은 김규원 교수(서울대) 연구팀이 암세포가 항암제나 방사선 치료 등의 스트레스 상황에서 살아남을 수 있도록 돕는 특정 단백질의 세포 방어 역할 방법을 규명하였다고 밝혔다.

암세포는 스트레스 상황에서 생존하기 위한 자가 방어 메커니즘이 잘 갖추어져 있다. 그 중 하나는 암세포 열 충격 단백질(Hsp70)의 발현이다. 암세포가 스트레스를 받으면 세포 내 단백질 구조에 손상을 입게 된다. 이때 발현된 Hsp70은 손상된 단백질을 처리하여 세포를 보호한다.

Hsp70은 손상된 단백질의 구조를 본래 상태로 복구시키거나, 분해하여 세포 내에서 완전히 제거해버린다. 그러나 이 단백질이 어떻게 ‘복구’와 ‘제거’를 구별하며, 두 과정이 어떻게 선택적으로 조절되는지에 대해서는 알려진 바가 없다.

이에 연구팀은 Hsp70의 아세틸화가, 손상된 단백질의 ‘복구’와 ‘제거’를 결정하는 스위치 역할을 한다는 사실을 밝혀냈다. 

연구팀은 암세포가 스트레스를 받으면 Hsp70의 77번째 아미노산(K77)이 효소(ARD1)에 의해 아세틸화*되는 것을 관찰하였다. 이처럼 체내 대부분의 단백질은 아세틸화를 치러 인체에 알맞게 변형된다.   Hsp70도 아세틸화를 치르면서 암세포 내 손상된 단백질의 처리를 결정하는 순간에 놓이게 된다.
    * 아세틸화 : 단백질 변형의 일종으로, 아세틸화 효소에 의해 단백질의 라이신(K) 잔기에 아세틸기가 첨가되는 반응이다.

스트레스 초기 시 Hsp70은 이라는 아세틸화 효소(ARD1)에 의해 아세틸화된다. 그러나 스트레스 후기에 접어들면 디아세틸화 효소(HDAC4)에 의해 탈아세틸화 된다.

스트레스 초기에 아세틸화된 Hsp70은 손상된 단백질을 복구하는 역할을 한다. 그러나 후기에 탈아세틸화된 Hsp70은 복구되지 못한 채 남아있는 손상 단백질을 제거하는 역할을 한다. 즉 Hsp70의 아세틸화/탈아세틸화의 순차적 과정이 손상 단백질을 ‘복구’ 할지‘제거’할지를 결정하고 진행하는 것이다.

따라서 암세포에서 Hsp70의 아세틸화를 차단하면, 암세포 내 손상된   단백질을 처리하는 과정에 문제가 생겨 항암치료에 대한 암세포의   치사율이 높아짐에 따라 효과적인 항암치료가 가능해지는 것이다.

김규원 교수는“이번 연구성과는 향후 Hsp70 아세틸화를 타겟으로 한 항암제 개발과 더불어 뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨씨병 등의 신경 질환을 예방하는 방법에도 응용될 수 있을 것이다.”라고 이번 연구의 의의를 밝혔다.

한국연구재단(미래창조과학부) 글로벌연구실지원사업과 글로벌핵심연구센터지원사업의 지원을 통해 거둔 이번 연구 성과는 네이처 자매지인 네이처 커뮤니케이션즈(Nature Communications)에 10월   6일자에 게재되었다.

논문의 주요 내용

논문명, 저자정보

   - 논문명 : ARD1-mediated Hsp70 acetylation balances stress-induced protein refolding and degradation
   - 저자 정보 : 김규원 교수 (교신저자, 서울대 약학대학),  서지혜 연구교수 (공동 제1저자, 서울대 약학대학), 박지현 박사 (공동 제1저자,   서울대 약학대학)

□ 논문의 주요 내용

 1. 연구의 필요성
  ○ 암세포는 대부분 활성 산소의 공격, 산소 부족과 같은 스트레스환경에서 만들어 진다. 따라서, 이러한 환경에서 살아남기 위해서 암세포에는 주변의 스트레스 상황으로부터 스스로를 보호하기 위한 방어 기전이 잘 갖추어져 있는데, 이는 암세포의 사멸을 방해하여 실제 항암 치료시 항암제나 방사선에도 암세포가 죽지 않도록 하는 방어 역할을 한다.
  ○ 암세포의 스트레스에 대한 대응 기전은 열 충격 단백질 (Heat shock protein, Hsp)들에 의해 이루어지는데, 이 중 Hsp70는 대표적인 열 충격 단백질이다. 스트레스를 받으면 세포 내의 단백질 구조가 손상을 입게 되는데, 이 때 Hsp70는 외부 스트레스에 의해 손상된 단백질을 처리하여 세포를 보호하는 역할을 한다.
  ○ Hsp70은 손상된 단백질을 처리하는 과정은 두 가지가 있다. 하나는, 손상된 단백질의 구조를 회복하여 원래 상태로 다시 복구하는 것이고, 다른 하나는 단백질을 분해하여 세포 내에서 완전히 제거해 버리는 방법이다. 이처럼, Hsp70는 "복구" 와 "제거" 라는 두 가지 상반된 작용을 통해 세포 내 단백질의 항상성을 유지한다. 하지만, Hsp70이 이러한 두 가지 작용을 어떻게 구별하고 선택적으로 조절하는지에 대해서는 알려진 바가 없다.
  ○ 이에 본 연구에서는 Hsp70의 이러한 기능을 조절하는 분자기전을 밝혀 암세포가 항암제와 같은 스트레스로부터 살아남는 기전을 규명하고자 하였으며, 동시에 이를 조절하여 항암제에 대한 암세포의 치사율을 높일 수 있는 새로운 방법을 제시하고자 하였다.

 2. 연구 내용
  ○ 그동안 Hsp70과 관련된 연구들은 전사 (transcription)에 의한 Hsp70의 발현 양  증가에 관한 것들이 많았다. 하지만, 본 연구팀에서는 스트레스에 즉각적으로 대응하기 위해서 전사보다 시간적으로 더 효율적인 단백질 변형 (modification)이 Hsp70의 기능 조절에 관여할 것이라는 가설을 세웠다.   ○ 이러한 가정 하에, 스트레스 상황에서 Hsp70의 단백질 변형을 조사하던 중, Hsp70의 K77 잔기가 ARD1 이라는 아세틸화 효소에 의해 아세틸화되는 것을 관찰하였다.
  ○ 그리고, Hsp70의 아세틸화와 비슷한 패턴으로 Hsp70의 기능이 단백질 “복구”와 “제거“ 사이에서 전환되는 것을 발견하였는데, 구체적으로는 Hsp70은 스트레스 초기에는 손상된 단백질을 복구하는 역할을 하고, 후기에는 손상된 단백질을 제거하는 역할을 하였다. 이에 의해, Hsp70의 두 기능이 아세틸화에 의해 전환될 것이라고 예상하였다. 
  ○ 실험 결과, Hsp70의 K77 아세틸화는 cochaperone 결합을 조절하여 Hsp70의 기능을 단백질 복구와 제거 사이에서 전환하는 스위치 역할을 하였다. 즉, 스트레스 초기에는 아세틸화된 Hsp70이 단백질 복구를 촉진하고, 후기에는 탈아세틸화된 Hsp70이 복구되지 못한 채 남아있는 손상 단백질들을 제거하였다. 
  ○ 아세틸화에 의한 Hsp70의 기능 전환은 스트레스 상황에서 단백질의 손상을 억제하여 암세포가 여러 가지 스트레스 상황에서 살아남는 데 필수적인 역할을 하였다.
  ○ 결론적으로, Hsp70의 아세틸화는 Hsp70이 스트레스에 의해 손상된 단백질의 복구/제거를 결정하는 일종의 스위치 역할을 하며, 이 스위치에 의해 Hsp70은 그 기능을 시기적절하게 전환하여 세포가 스트레스에 상황에 대응하여 살아남는 것을 가능케 한다.
 3. 연구 성과
  ○ 본 연구를 통해 인체의 스트레스에 대응하는 방어 기전을 이해할 수 있게 되었으며, 특히, Hsp70의 아세틸화를 통해 암세포들이 항암제와 같은 스트레스 상황으로부터 살아남는 기전을 규명하였다.
  ○ 본 연구에서는 Hsp70의 아세틸화를 차단하였을 때, 항암제에 대한 암세포의 치사율이 높아지는 것을 확인하였으므로, 향후 Hsp70의 아세틸화를 타겟으로 한 항암제 개발이 가능할 것으로 보인다.
  ○ 뿐만아니라, Hsp70에 의한 스트레스 방어 기전은 암세포 외에도, 뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨씨병 등 다양한 신경 질환에서 인체를 보호하는 작용을 한다는 것이 알려져 있으므로, 본 연구 결과는 다양한 신경 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 방법에도 응용될 수 있다.

연 구 결 과  개 요

 1. 연구배경
  ㅇ 인체는 외부 환경의 스트레스로부터 스스로를 보호할 수 있는 방어 능력을 가지고 있다. 세포가 갑작스러운 고열이나, 저산소, 독성 물질 등과 같은 공격적인 외부 환경에 노출되면 스스로를 방어하기 위해 열 충격 반응 (Heat Shock Response) 이라는 방어 기전을 작동한다. 특히, 이러한 열 충격반응은 기전 특히 암세포에서 매우 잘 발달되어 있는데, 암세포는 이러한 방어 기전을 이용하여 인체내부의 스트레스로부터 살아남는다. 따라서, 암을 억제하기 위해서는 이러한 암세포의 스트레스 대응 기전에 대한 이해가 필수적이다. 

  ㅇ 열충격 반응은 스트레스에 의해 발현되는 열 충격 단백질 (Heat shock protein, Hsp)들에 의해 이루어지는데, 이 중 Hsp70는 스트레스로부터 세포를 보호한다고 알려진 대표적인 열 충격 단백질이다. 세포가 스트레스를 받으면 세포 내의 단백질 구조가 손상을 입게 되는데, 이 때 Hsp70는 외부 스트레스에 손상된 단백질의 구조를 회복 (repair) 시켜 복구하거나, 손상된 단백질을 분해 (degradation) 하여 세포 내에서 완전히 제거해버리는 역할을 한다. 이처럼 Hsp70은 스트레스 상황으로부터 세포를 보호하기 위해 손상된 단백질의 "복구" 와 "제거" 라는 상반된 두 기전을 통해 세포 내 단백질의 항상성을 유지한다. 하지만, Hsp70가 이러한 두 가지 상반된 작용을 어떻게 구별하고 선택적으로 조절하는지에 대해서는 알려진 바가 없다.

  ㅇ Hsp70 단백질은 스트레스에 반응하여 발현되는 특징을 가지고 있어서, 정상 세포는 평소 Hsp70를 발현하지 않지만, 특이하게도 암세포는 평소에도 높은 수준의 Hsp70를 발현하고 있다. 암세포는 대부분 활성 산소의 공격, 산소 부족과 같은 스트레스환경에서 만들어 진다. 따라서, 이러한 환경에서 살아남기 위해서 암세포는 주변의 스트레스 상황으로부터 스스로를 보호하기 위해 Hsp70의 발현을 높은 수준으로 유지하고 있으며, 이는 암세포의 사멸을 방해하여 실제 항암 치료시 항암제나 방사선에도 암세포가 죽지 않도록 하는 방어 역할을 한다. 따라서, 암세포의 Hsp70의 활성을 억제하는 것은 암 치료분야에 있어서 중요한 타겟으로 여겨져 왔다. 하지만, Hsp70의 단백질 활성이 조절되는 분자 기전에 대해서는 현재까지 알려진 바가 없어, Hsp70의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 방법을 개발하는 데에는 한계가 있었다.

2. 연구내용
  ㅇ Hsp70은 협력하는 cochaperone의 종류에 따라 수행하는 기능이 단백질 복구와 제거로 달라진다. 본 연구에서는 Hsp70의 이 두 가지 기능이 스트레스 상황에서 어떻게 전환되는지를 알아보기 위해 cochaperone의 결합을 조사하였다. 흥미롭게도 Hsp70는 스트레스 초반에는 손상된 단백질을 복구하는 cochaperone 들과 결합하다가, 후기로 갈수록 손상된 단백질을 분해하는 데 필요한 cochaperone들과 결합하였다. 이는 Hsp70이 스트레스 초기에는 단백질을 복구하다가, 지속적인 스트레스로 인해 손상이 누적되어 단백질 복구가 힘들어지면, 변형된 단백질을 분해하여 하는 작용을 하는 것으로 그 기능을 전환함을 시사한다.

  ㅇ 이러한 Hsp70의 기능 전환에 단백질 변형 (posttranslational modification)이 관여되어 있는지를 확인하기 위해, 스트레스 유도 후 Hsp70의 아세틸화를 관찰하였다. 그리고, Hsp70의 기능 전환과 비슷한 패턴으로 스트레스 초기에는 Hsp70의 아세틸화가 증가하다가 후반으로 갈수록 감소하는 것을 발견하였다. 이 결과는 Hsp70의 두 가지 상반된 기능이 아세틸화에 의해 전환될 가능성을 시사한다. 

  ㅇ 이러한 Hsp70의 아세틸화를 매개하는 단백질로서 ARD1이라는 아세틸화 효소를 규명하였다. 스트레스 상황에서 ARD1이 Hsp70의 K77 잔기를 아세틸화시키는 것을 확인하였다.

  ㅇ ARD1에 의한 Hsp70의 K77 잔기의 아세틸화는 cochaperone 결합을 조절하여 Hsp70의 기능을 단백질 복구와 제거 사이에서 전환하는 스위치 역할을 하였다. 스트레스 초기에는 Hsp70이 아세틸화되어 단백질 복구를 촉진하고, 후기로 가면 탈아세틸화에 의해 Hsp70의 기능이 단백질 분해로 전환되어 복구되지 못한 단백질을 제거한다.

  ㅇ 또한, 이러한 Hsp70의 기능 전환은 스트레스 상황에서 단백질의 손상뿐 아니라 세포의 생존율에도 기여하였는데, 특히 암세포가 여러 가지 스트레스 상황에서 살아남는 데 필수적이었다.

  ㅇ 추가적으로 제브라피쉬 모델을 이용하여 실제 생체내에서 Hsp70의 아세틸화가 스트레스 조건에서 제브라피쉬의 생존률 및 신경 보호 역할을 하는 것을 확인하였다.

  ㅇ 결론적으로, 스트레스 상황에서 ARD1은 Hsp70을 아세틸화시키며, Hsp70의 아세틸화는 Hsp70이 손상된 단백질을 복구할지 제거할지를 결정하는 일종의 스위치 역할을 한다. 이 스위치에 의해 Hsp70은 그 기능을 시기적절하게 전환하여 세포가 스트레스에 상황에 대응하여 살아남는 것을 가능케 한다.

3. 기대효과
  ㅇ 본 연구를 통해 인체의 스트레스에 대응하는 방어 기전을 이해할 수 있게 되었다. 특히, Hsp70의 아세틸화를 통해 암세포들이 항암제와 같은 스트레스 상황으로부터 살아남는 기전을 규명하고, Hsp70의 아세틸화를 차단하여 항암제에 대한 암세포의 치사율을 높이는 방법을 제시하였으므로, 향 후 Hsp70의 아세틸화를 타겟으로 항암제 개발이 가능할 것으로 보인다. 뿐만아니라, Hsp70에 의한 스트레스 방어 기전은 암세포 외에도, 뇌졸중, 알츠하이머, 파킨슨씨병 등 다양한 신경 질환에서 인체를 보호하는 작용을 한다는 것이 알려져 있으므로, 본 연구 결과는 다양한 신경 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 방법에 응용될 수 있다.

 ★ 연구 이야기 ★

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

본 연구실에서는 아세틸화에 의한 혈관 신생 조절 작용을 규명한 바가 있다. 이에 대한 후속 연구의 일환으로 세포의 여러 기능을 조절하는 ‘스위치’로서 아세틸화를 연구하던 중, 스트레스로부터 세포를 보호하는 샤페론인 Hsp70이, 세포 스트레스 상황에서 아세틸화됨을 관찰하였다. Hsp70의 아세틸화는 당시로선 보고된 바 없는 흥미로운 발견이었으므로, 이러한 현상이 세포 스트레스 상황에서 수행하는 기능 및 작용기전 연구에 착수하게 되었다.

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

Hsp70을 아세틸화시키는 단백질로서, 아세틸화 효소 ARD1이 Hsp70에 결합함을 이화여대 이공주 교수님께서 분석해 주셨다. 이를 in vitro 및 세포 실험을 통하여 확인한 후, 광주 과기원 박지용 교수님의 도움으로 Hsp70 아세틸화 잔기(K77)를 동정할 수 있었다. 잔기 동정 후에는, 이 잔기를 아세틸화(K77Q)와 탈아세틸화(K77R)된 형태로 돌연변이시켜, 아세틸화에 의한 Hsp70의 기능 변화를 확인하였다. 또한 이를 확장하여 세포 및 생체 내에서 Hsp70의 아세틸화에 의한 보호 효과를 확인하였다. Hsp70의 아세틸화가 Hsp70의 기능 변화를 조절하는 작용 기전을 서울대 이봉진 교수님의 도움을 받아 구조적으로 해석할 수 있었다.

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

‘샤페론’ 분야는 본 연구실에서는 다루지 않았던 생소한 분야로서, 이와 관련된 배경 지식 및 실험 기법을 공부하고 구축해야하는 부담이 있었다. 또한 mass spectrometry를 통한 결합 단백질 분석, 아세틸화 잔기 동정, 그리고 구조적 의미 해석 등 연구에 필수적이지만 본 연구실에서 수행할 수 없는 분석이 많아, 실험 기간이 길어졌다. 다행히 여러 연구실의 적극적인 도움 및 자문을 얻어 필요한 분석을 무사히 진행할 수 있었다. 또한 연구 기간이 길어짐으로써 중간에 Hsp70의 아세틸화 및 인산화에 의한 기능 변화가 보고되어 본 연구의 신규성이 떨어진 아쉬움이 있었다. 이는 본 연구가 스트레스 전반에 적용될 수 있다는 점, 스트레스 상황에서 시간에 따른 Hsp70의 역동적인 기능 변화를 보고했다는 점, 특히 이러한 특징으로 인해 Hsp70이 과발현되어 있는 암세포에서 의미가 있으며, Hsp70/Hsc70의 기능 차이의 실마리가 될 수 있다는 점 등을 강조함으로써 보완할 수 있었다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

Hsp70을 포함한 대부분의 샤페론은 주로 전사 조절을 통해 발현량이 조절되어 기능한다고 알려져 있다. 즉, 스트레스 상황이 오면 HSF1과 같은 전사 인자가 이들 샤페론의 발현을 유도하는 것이다. 그러나 본 연구는 이러한 전사에 의한 조절 외에도, Hsp70의 발현량이 변하지 않는 상황에서 Hsp70의 역동적인 기능 변화를 보았다는 데에 그 의의가 있다. 많은 생리적 스트레스 상황에서 Hsp70의 양이 변하지 않으며, 특히 암세포는 스트레스가 없는 상황에서도 이미 Hsp70을 과발현하고 있는데, 본 연구는 이러한 경우에도 Hsp70이 아세틸화에 의해 그 기능이 조절됨을 보고하였다.
또한 이러한 조절 기전은 정상 세포 기능을 담당하는 Hsc70에는 적용되지 않아, 정상 세포의 기능은 유지하고 암세포에만 특이적으로 작용하는 Hsp70 특이적 저해제 개발의 가능성을 제시한다.
결론적으로 본 연구는 아세틸화가 Hsp70 기능 조절의 ‘스위치’ 역할을 함을 밝혔으며, 샤페론 분야전반에 큰 영향력이 있을 것이라 기대한다.

□ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은?

본 연구는 일반적인 세포 스트레스 상황에서 수행한 연구로, 특정 질병 상황으로의 확장이 필요하다. Hsp70이 관련이 되어 있다고 알려져 있는 각종 암, 신경 퇴행성 질환, 염증 관련 질환에서 Hsp70의 아세틸화에 의한 기능 조절이 작동하는지 확인하고, 이를 이용해 이들 질환의 치료제 개발을 시도할 수 있을 것이다.
또한 Hsp70은 세포 외로 분비되어 근처 세포에 흡수되거나 또는 혈액 순환으로 전신에 영향을 줄 수 있다고 알려져 있으므로, 분비되는 Hsp70을 타겟으로 하여 여러 질환에 대한 연구 및 치료제 개발을 시도할 수 있다.

□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?

구조 해석의 과정에서, 처음에 Hsp70의 일부 도메인만으로 구조적 의미를 해석하였는데, 아세틸화 잔기의 위치가 Hsp70의 기능에 중요하다고 알려진 위치와 멀어서 몇 달간 해석에 곤란함이 있었다. 그러나 Hsp70 전체의 구조를 보니, 아세틸화 잔기가 도메인끼리 상호작용하는 접촉면에 존재한다는 사실을 알 수 있었다. 부분을 들여다보면 풀리지 않던 문제가, 시야만 달리하면 쉽게 풀릴 수 있다는 교훈을 얻게 되었다.

그림 1. 스트레스에 의한 Hsp70의 아세틸화 및 기능 전환 규명
A. Hsp70의 두 가지 샤페론 기능. Hsp70은 스트레스에 의해 변형된 단백질을 ‘복구’하거나 ‘분해’하여 단백질 항상성을 유지함. B. 스트레스에 의한 Hsp70 아세틸화 및 샤페론 기능 전환. 과산화수소(H2O2) 처리로 유도된 세포 스트레스 상황의 초기에 Hsp70이 아세틸화 되었다가 후기에 탈아세틸화 됨. 이와 함께 스트레스 초기에는 단백질 복구를 담당하는 Hop, Hsp90이 Hsp70과 결합하고, 후기에는 단백질 분해를 담당하는 CHIP, Hsp40이 결합함.

그림 2. Hsp70 아세틸화에 의한 세포 보호 효과 규명
A. Hsp70의 아세틸화 잔기 규명. ARD1이 Hsp70을 아세틸화 시키며, 아세틸화 잔기는 라이신 77번(K77)임을 동정함. B. Hsp70의 아세틸화에 의한 세포 보호 효과 규명. 정상 Hsp70(WT)과 탈아세틸화 돌연변이(K77R)를 발현하는 세포에 스트레스 물질을 처리하여 세포 보호 효과를 관찰함. 정상 Hsp70은 세포 보호 효과를 보이는 반면, 탈아세틸화 돌연변이는 세포 보호 효과가 없음을 확인함.

그림 3. 스트레스에 의해 유도된 Hsp70 아세틸화에 의한 샤페론 기능 조절 및 세포 보호 효과 규명
스트레스 초기에 Hsp70이 아세틸화 되어 변형된 단백질을 복구하며, 후기에 탈아세틸화 되어 변형된 단백질을 분해하여 제거함. 이러한 가역적인 샤페론 기능의 전환은 결과적으로 스트레스 상황에서 세포를 보호하는 데에 기여함.