국내연구진이 면역세포가 침입물질이 아닌 자기 세포를 공격하도록 유도하는 단백질을 억제해 자가면역 증상을 완화해 주는 단백질 신약후보물질을 개발했다. 향후 다발성 경화증*, 류마티스 관절염** 같은 자가면역 질환에 대한 치료제 개발의 실마리가 될 것으로 기대된다.
  * 다발성 경화증 : 뇌 또는 척수와 같은 중추신경계를 공격하는 자가면역질환으로, 신경이 퍼져있는 몸 전체에 마비 증상을 일으킴.
 ** 류마티스 관절염 : 관절을 싸고 있는 활막에 염증이 생기는 자가면역질환으로 점차 연골과 뼈로 염증이 퍼져 관절을 파괴하고 변형시킴

연세대 생명공학과 이상규 교수 주도로 박태윤 박사가 제1저자로 참여한 이번 연구는 미래창조과학부가 추진하는 선도연구센터지원사업의 지원으로 수행되었고, 연구결과는 미국국립과학원회보 PNAS(Proceedings of National Academy of Sciences USA) 12월 19일자 온라인판에 게재되었고 100주년 기념호인 1월호에 게재될 예정이다.
      (논문제목 : RORγt-specific transcriptional interactomic inhibition suppresses autoimmunity associated with TH17 cells.)

기존에는 특정 면역세포에서 자가면역 반응을 유발하는 핵심 단백질(RORγt*)을 억제하기 위해 이 단백질과 결합하는 항체나 화학물질을 개발하려는 연구가 대부분이었다.
   * RORγt : 다양한 림프구중 하나인 T세포 가운데 자가면역질환을 일으키는 TH17세포로의 분화 및 기능에 관여하는 많은 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자

하지만 항체는 세포 내 전달이 쉽지 않고, 화학물질은 부작용 검증 등에 많은 비용과 오랜 시간이 걸린다는 단점이 있었다.

연구팀은 자가면역 단백질의 일부 조각을 투여, 세포 내에 원래 존재하는 자가면역 단백질을 방해함으로써 자가면역 반응을 억제하는 새로운 방식의 접근을 시도했다. 결합할 수 있는 특정 DNA 부위를 두고 두 단백질이 서로 경쟁하도록 한 것이다. 

실제 앞선 연구팀이 개발한 단백질 전달체(Hph-1-PTD*)에 이 자가면역 단백질의 일부분을 결합시켜 다발성 경화증 생쥐모델에 주입하자 마비증상 같은 자가면역 증상이 완화되었다는 설명이다.
 * Hph-1-PTD(Protein Transduction Domain) : 세포 내로 전달하기 어려운 단백질, RNA, DNA 또는 화학합성물을 높은 효율로 세포 내로 전달하는 펩타이드

특히 화학물질과 달리 단백질로 된 신약후보물질은 일정시간이 지나면 세포 내에서 분해되어 사라지고 표적 세포에 대한 특이성도 높아 부작용의 우려가 낮다는 것이 장점이다. 

이 교수는 “기존 화학합성물이나 항체를 이용한 자가면역 질환 치료제 시장에 새로운 개념의 단백질 의약품 개발의 가능성을 제시한 것으로 전사인자가 원인이 되는 많은 질환에 대한 치료제 개발에 응용될 수 있을 것”이라고 밝혔다.

연 구 결 과  개 요

1. 연구배경

급격한 경제성장에 따른 환경오염, 불량한 식습관 및 과도한 스트레스 등에 의하여 30년 전만 해도 희귀병에 가까웠던 자가면역질환 환자들이 현재는 전 세계 인구의 약 1% (류마티스 관절염 기준)가 앓고 있을 정도로 빈번한 질환이 되었다.

하지만 현재까지 개발된 자가면역질환 치료제의 대부분은 화학합성물로 많은 개발비용 및 오랜 기간이 소요되고 다양한 부작용을 보이고 있고, 항체치료제의 경우 고가의 치료비 및 의료비, 부작용 및 치료저항성이 문제가 되고 있어 새로운 치료 방법 개발이 시급한 실정이다.

따라서 본 연구진은 자가면역질환 치료제가 한 두개의 염증인자의 기능을 저해하는 기존의 개념을 떠나서 질환이 있는 부위의 염증미세환경 전체를 제어해야 한다는 새로운 개념을 가지고, 염증미세환경의 형성에 가장 핵심적인 세포인 Th17 and Th1 세포의 분화 및 기능을 전사인자수준에서 제어하여 이들 세포들이 만들어내는 중요한 염증활성인자들 모두의 발현을 저해하는 치료제를 개발하고자 하였다.

또한 화학합성물이 아닌 좀 더 안전성이 보장된 생체 내에 존재하는 단백질을 이용하였고, 세포 외 타깃에 국한되었던 기존 약물의 한계를 극복한 세포 내 타깃으로 제작된 치료제 개발의 핵심 원천기술을 제공하고자 하였다.

2. 연구내용

본 연구진은 전사인자의 일부분이면서 그 기능적 특이성을 가진 부분을 세포수준 및 질환동물모델 수준에서 세포의 핵 내로 전달하여 세포가 원래가지고 있는 전사인자의 기능을 경쟁적으로 동시에 선택적으로 제어하는 새로운 개념의 단백질신약후보물질을 개발하는 핵심원천기술을 개발하여, 이 기술을 EAE 및 RA 자가면역질환 치료제개발에 적용하여 새로운 단백질신약 후보물질을 개발하여 질환 치료효과를 연구하고자 하였다.

기존 선행연구에서 현재의 기술로는 생체/세포 내로 전달이 불가능한 단백질 또는 유전자를 효과적으로 전달할 수 있는 인간유래의 단백질 전달 펩타이드인  Hph-1-PTD을 세계 최초로 발굴하였다. 이 핵심원천기술을 이용하여, 다발성 경화증을 유발하는데 있어 핵심이 되는 TH17에 특이적으로 존재하면서 이들 T 세포로의 분화·활성에 중요한 전사인자 RORγt의 전사인자기능에 핵심부분을 단백질전달 펩타이드인 Hph-1-PTD와 융합시킨 단백질신약 후보물질인 tRORγt-TMD를 완성하였다.

이들 단백질 신약후보물질들은 TH17 세포 내에서 RORγt에 의하여 유도되는 IL-17을 포함한 많은 유전자들의 발현을 저해하여  TH17의 분화 및 기능을 효과적으로 제어하였으나, 다른 T cell subset들의 분화 및 기능에는 전혀 영향을 주지 않는 높은 기능적 선택성을 가지고 있음을 증명하였다.

또한 이들 단백질 신약후보물질들을 처리한 다른 세포들은 정상적인 수준의 세포성장 및 활성화과정을 유지하고 있어 신약개발시 항상 큰 문제가 되는 세포독성이 전혀 없는 것으로 밝혀졌다.

다발성 경화증 동물모델(EAE) 생쥐에 tRORγt-TMD를 투여함으로서 사지가 마비되어가는 생쥐가 정상 쥐로 치료되어지는 효과를 확인하였으며 미리 투여 받은 생쥐의 경우에는 마비 증세를 보이지 않는 결과를 얻은 것은 이 단백질신약후보물질이 질환치료효과뿐만 아니라 질환을 방지하는 효과도 동시에 있음을 확인하였다.

이는 전달된 단백질 신약후보물질이 TH17 세포에 특이적으로 존재하는 전사인자인 RORγt의 기능을 효과적으로 제어하여, 림프계 기관에 존재하는 naive T 세포들이 질환을 일으키는 병인세포인 TH17 세포로 분화되지 못하였기 때문이고, 또한 RORγt 전사인자에 의하여 유도되는 IL-17등의 다양한 유전자들의 발현이 제어되어 다양한 질환유도세포들이 중추신경계로의 이동이 차단되었기 때문임을 증명하였다.

본 연구진이 개발한 핵심원천기술을 RORγt가 아닌 다른 전사인자에도 공통적으로 적용되는 지를 검증하기위하여, 또 다른 자가면역질환인 류마티스 관절염을 유발하는데 있어 핵심이 되는 TH1 세포로의 분화·활성에 중요한 전사인자 Tbet의 기능을 제어할 수 있는 또 다른 단백질신약후보물질인 tTbet-TMD를 제작하였다.

tTbet-TMD 역시 다른 T cell subset들의 분화 및 기능에는 전혀 영향을 주지않고 TH1 세포에서 특이적으로 유도되는 많은 유전자들의 발현만을 선택적으로 억제하는 효과를 보였다. 또한 TH1 세포가 병인적인 역할을 하는 류마티스 관절염 동물모델(CIA) 생쥐에 tTbet-TMD를 투여하였을 때, 염증으로 인한 발의 붓기가 줄어들었고 관절염 수치도 현재 승인된 약물 메토트렉세이트(MTX) 만큼이나 확연히 줄어들었음을 밝혔다.

3. 기대효과

다양한 전사인자들이 질환의 발생 및 유지에 핵심적인 역할을 하는 많은 타 질환들에 대한 새로운 개념의 단백질신약개발에 많은 파급효과를 줄 것으로 예상된다. 또한 바이러스를 이용하지 않고 전사인자의 기능부여 및 제어가 핵심기술인 줄기세포 연구분야에서도 핵심적인 기술로 사용될 것으로 생각된다.

현재 본 연구진은 다른 자가면역질환에 병인적인 역할을 하고 있는 TH2 세포의 GATA-3, Treg 세포의 Foxp3 또는 Smad3 전사인자들의 기능을 제어할 수 있는 단백질신약후보물질들을 개발하여, 그 질환치료효과를 동물모델에서 이미 검증하였다.

연 구 결 과 문 답

이번 성과 뭐가 다른가

많은 질환들의 발생 및 유지에 관여하지만 그 기능을 조절하기 어려운 것으로 알려진 전사인자의 기능을 효과적으로 제어할 수 있는 핵심원천기술이다. 자가면역질환을 일으키는 두 개의 다른 전사인자에 적용해 새로운 개념의 단백질 신약후보물질을 개발하여 세포 및 동물모델에서 질환치료효과를 검증하였다.

어디에 쓸 수 있나

자가면역질환 뿐만 아니라, 전사인자가 핵심적인 역할을 하는 여러 질환들에 대한 새로운 개념의 단백질신약개발이 가능하게 하였다.

실용화까지 필요한 시간은

후보물질 발굴에서 임상시험 완료까지 15년 이상 걸리는 기존 화학신약과 달리 본 연구진의 단백질 신약후보물질은 임상시험을 완료하는데 10년 이하의 짧은 개발기간과 적은 개발비용이 소요될 것으로 예상된다.

실용화를 위한 과제는

실용화를 위해 국내외 제약사들의 연구개발참여를 통하여 본 연구진이 부족한 임상시험에 대한 도움이 필요하다.

연구를 시작한 계기는

단순히 한두개의 유전자 또는 단백질의 기능을 제어하는 기존 연구를 벗어나서, 질환유도 및 진행에 관여하는 질환미세환경 전체를 조절할 수 있는 보다 근본적인 연구타겟이 전사인자라는 것을 인식하였다.
전사인자를 화학신약 또는 항체신약으로 제어하려는 기존 개념에서 벗어나 단백질을 세포의 핵 내로 직접 전달하여 전사인자의 기능을 제어하려는 아이디어에서 출발했다.

꼭 이루고 싶은 목표는

많은 기초 및 임상 연구자들과 공동연구를 통하여 다양한 질환들의 유도 및 진행에 관여하는 전사인자들의 기능를 조절할 수 있는 전사인자 단백질신약 라이브러리를 구축하는 것이다

신진연구자를 위한 한마디

세계적 연구진이 현재 사용하는 기술에 의존하지 말고 새로운 아이디어에 도전하는 정신이 중요하다.

그림 1. 특정 전사인자를 선택적으로 조절하는 기술에 대한 방법

(왼 쪽) TH17 세포 내에서 IL-17 사이토카인을 코딩하는 유전자의 발현조절부위에 RORγt 단백질의 DNA-결합도메인(DNA-binding domain, 노란색)이 결합하고 리간드-결합도메인(ligand-binding domain, 붉은색)에 여러 전사 관련 단백질들이 결합하면 전사복합체(Transcriptional complex)가 정상적으로 이루어지면서 전사가 일어난다.
(오른쪽) 전사인자 조절 약물(tRORγt-TMD)은 DNA-결합도메인 및 기능특이적 도메인을 지니기 때문에 IL-17 유전자의 발현조절부위에 결합은 할 수 있지만 전사복합체를 이루기 위한 여러 전사 관련 단백질들이 결합하지 못해 정상적인 전사가 일어나지 않는다.

그림 2. tRORγt-TMD에 의한 TH17 세포 분화 억제 및 다발성 경화증 질환 치료 효과

A. 미경험 T 세포(naive T cell)에 tRORγt-TMD를 전달한 후 TGFβ1과 IL-6 사이토카인을 이용하여 TH17 세포로 분화를 유도하면 약물을 처리하지 않은 군에서는 IL-17A 사이토카인 발현양이 증가하지만, 약물을 처리한 군에서는 처리농도가 높아질수록 IL-17A 사이토카인의 발현양이 줄어든 것을 보고 분화가 억제되었음을 확인할 수 있다.

B. A 실험 결과를 좀 더 정확하게 분석하고자 tRORγt-TMD 처리한 세포와 처리하지 않은 세포의 유전자들을 마이크로어레이(microarray) 분석법을 이용하여 확인해 본 결과 tRORγt-TMD에 의하여 TH17 세포로의 분화가 억제되어 TH17 세포 관련 모든 유전자(IL-21, CCL20, CCL2/3/4, CCR2/5, IL-12Rb1, TLR4, IL23R)의 발현이 억제되었음을 확인할 수 있다.

C. 다발성 경화증의 동물질환 모델인 EAE (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis) 생쥐에 tRORγt-TMD의 예방효과를 확인하기 위하여 질환유도 첫 날부터 이틀에 한번 씩 주입한 결과 주입하지 않은 군에서는 9일째부터 꼬리에 마비가 오기 시작하면서 20일 경에는 앞다리/뒷다리 모두 마비가 오지만 주입해 준 쥐는 마비증상이 거의 없이 정상을 유지하였다.

D. tRORγt-TMD의 치료효과를 확인하기 위하여 마비가 이미 진행되어 있는 생쥐에 주입한 결과 주입 즉시부터 상태가 호전되어 6일 만에 정상화 되었다. 대조군으로 사용된 anti-IL17 항체는 현재 치료약물로 사용되고 있다.

그림 3. tTbet-TMD에 의한 류마티스 관절염 질환 치료 효과
A. 류마티스 관절염 동물모델인 CIA(Collagen-induced Arthritis) 생쥐에 tTbet-TMD의 치료효과를 확인하기 위해 60일간 이틀에 한번 씩 주입한 결과 관절염 수치가 낮아지는 것을 확인하였다. 대조군으로 사용된 MTX(Methotrexate)는 현재 치료약물로 사용되고 있는 화학합성물이다.
B, C. 류마티스 관절염으로 발생한 염증반응으로 발의 붓기가 증가하는데 반해 tTbet-TMD를 처리한 군에서는 붓기가 증가하지 않았다.