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신경전달물질 분석시스템 개발, 보톡스 대체물 발굴 기대...광주과학기술원 전영수 교수팀
Bio통신원(미래창조과학부)
국내 연구진이 인간 신경세포들 사이에서 신호를 전달하는 과정인 시냅스소낭 막융합*을 안정적으로 분석하는 시스템을 개발했다. 신경전달 과정에 대한 이해는 물론, 보톡스** 같은 신경전달에 관여하는 물질의 발굴을 위한 핵심도구로 활용될 것으로 기대된다.
* 시냅스소낭 막융합 : 신경세포에서 다른 신경세포로 신호를 전달할 때, 감정, 행동, 기억 등 두뇌활동을 매개하는 신경전달물질(neurotransmitter)이 담긴 시냅스소낭(synaptic vesicle)이 신경세포막과 막융합을 통해 시냅스 간극으로 신경전달물질을 분비하는 과정
** 보톡스 : 보툴리늄 세균이 분비하는 신경독소. 시냅스소낭 막융합에 관여하는 스네어 단백질을 제거하는 방식으로 신경신호 전달을 억제하며, 통증치료와 미용치료에 사용되며, 부작용으로 근육마비 또는 사망 위험 등이 지적됨
광주과학기술원(GIST) 생명과학부 전영수 교수(교신저자)가 주도하고 고영준, 이미리암 연구원(공동 제1저자)이 수행한 이번 연구는 미래창조과학부와 한국연구재단이 추진하는 선도연구센터지원사업과 GIST 바이오광학영상센터연구사업의 지원으로 수행되었고, 연구결과는 국제학술지 미국국립학술원회보(PNAS) 온라인판 5월12일자에 게재되었다.
(논문명 : In vitro assay using engineered yeast vacuoles for neuronal SNARE-mediated membrane fusion)
신경세포 간의 신호전달의 핵심은 신경세포 안에 존재하며, 다양한 신경전달물질을 담고 있는 시냅스소낭이 신경세포의 막과 융합하는 과정이다.
신경전달물질 연구에서 시냅스소낭 막융합 과정을 분석하기 위해 신경세포의 생체막을 이용하는 것이 좋지만, 비용이 많이 들고, 분석이 어렵다. 현재 합성리포좀을 이용하는 방식이 널리 사용되고 있으나, 실험결과의 해석은 용이하지만, 합성물질이라는 한계가 있었다.
이에 연구팀은 사람의 스네어* 유전자를 가진 효모**를 제작하고, 인간 시냅스소낭 막융합을 모방한 효모 액포*** 사이의 막융합 반응을 시험관에서 구현하였다.
* 스네어(SNARE) : 생체막융합을 유도해 세포 내 물질이동을 조절하는 단백질
** 효모(yeast) : 빵이나 맥주 등 발효에 이용되는 단세포 생물. 사람세포처럼 세포내 핵(nucleus)을 갖는 진핵세포여서 실험모델로 많이 이용된다.
*** 액포(vacuole) : 사람 세포의 리소좀에 해당하는 효모의 세포 소기관으로 단백질, 지질 등 다양한 생체 고분자 물질의 분해 및 재활용이 일어난다.
동 방식은 효모에서 매번 동일한 스네어 단백질을 가진 액포를 분리, 정제할 수 있어 기존 분석시스템의 재현성 문제를 극복할 수 있으며, 효모는 대량 배양에 유리하기 때문에 화합물 발굴 등 대규모 스크리닝 연구에 응용할 수 있다는 것도 장점이다.
향후 신경전달 과정을 조절하는 화합물 발굴, 개발, 검증 등에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
효모의 액포막융합 과정은 인간신경세포의 시냅스소낭 막융합을 억제한다고 알려진 보톡스에 의해 반응이 억제됐다.
전영수 교수는 “개발된 분석시스템이 인간의 시냅스소낭 막융합의 특성을 그대로 보여주고 있어 동 연구성과는 보톡스의 효능개선, 대체물 개발 등 다양한 연구활동에 기여할 것”이라고 밝혔다.
연 구 결 과 개 요
1. 연구 배경
감정, 행동, 기억 등 인간의 두뇌 활동은 궁극적으로 뇌를 이루고 있는 신경세포간의 다양한 상호작용에 의해 일어난다. 그 대표적인 예가 신경전달(neurotransmission)이다. 이는 한 신경세포에서 분비된 신경전달물질(아세틸콜린 등)이 시냅스라는 신경세포간 연결부에서 다른 신경세포의 수용체에 의해 인지됨으로써 특정 신호가 한 신경세포에서 다른 신경세포로 전달되는 과정이다.
신경전달물질 분비는 세포 내에서 신경전달물질을 저장하고 있는 시냅스 소낭과 신경세포막간의 막융합에 의해 일어나는데, 이러한 과정을 ‘시냅스소낭 막융합’이라고 한다. 이는 신경전달이 정교하고 신속하게 일어날 수 있도록 조절하는 매우 중요한 과정이다. 따라서 다양한 신경작용을 인위적으로 제어하거나 신경관련 질환을 치료하기 위한 타깃으로 신경전달 및 시냅스소낭 막융합 과정은 오랫동안 많은 연구의 대상이었다.
그럼에도 불구하고, 여전히 시냅스소낭 막융합의 분자기전은 많은 부분이 밝혀지지 않고 남아있는 상황이다. 이유 중 하나로 시냅스소낭 막융합과정을 분석할 수 있는 시스템이 극히 제한적이라는 것을 들 수 있다. 신경세포를 사용한 시냅스소낭 막융합 연구는 비용이 많이 들고 연구방법도 매우 제한적이어서 분자기전 연구나 대용량 분석연구에는 적합하지 않다.
현재 가장 널리 사용되는 시냅스소낭 막융합 분석시스템은 합성 리포좀에 시냅스 스네어 단백질을 도입하여 제작한 스네어 단백질리포좀(proteo liposome)을 이용한 방법인데, 이는 생체막이 아닌 인공 리포좀을 사용한다는 한계와 더불어 단백질 발현 및 분리정제의 문제, 계면활성제 사용의 문제, 재현성 부족 및 높은 숙련도 요구 등 근본적인 한계가 있다. 또 합성리포좀 연구결과가 생체막 또는 신경세포를 이용한 실험에서 얻은 결과와 상충되는 등 많은 문제점이 지적되어 왔다. 따라서 시냅스소낭 막융합을 손쉽고 신속하게 저비용 및 대용량으로 분석할 수 있는 분석시스템은 현재 없는 상황이다.
2. 연구내용
본 연구에서는 합성생물학(synthetic biology)적 방법론으로 인간 신경세포에서 시냅스소낭 막융합을 매개하는 단백질인 스네어 단백질(syntaxin, SNAP25, synaptobrevin) 유전자를 효모(yeast)에 도입하여 형질전환 효모를 제작하고, 이 효모 균주로부터 액포(vacuole)를 분리정제한 뒤, 시험관에서 시냅스 스네어 단백질에 의한 액포간 막융합을 유도하였다.
그 결과 시냅스 스네어 단백질만으로도 액포간 막융합이 관찰되었고, 이 액포막융합 과정은 이미 알려진 시냅스소낭 막융합 촉진인자에 의해 촉진되고 막융합 억제인자에 의해 억제되었다. 이는 생체막융합 연구분야에서시냅스 스네어 단백질이 생체막융합을 일으킬 수 있는 필요충분 인자임을 규명한 점에서 그 의의가 크다.
확립된 형질전환 효모균주로부터 매번 동일한 시냅스 스네어 단백질을 포함하는 액포를 분리ㆍ정제할 수 있기 때문에, 합성리포좀을 이용한 시냅스소낭 막융합연구의 재현성 문제를 극복할 수 있게 되었다. 또 대량배양이 가능한 효모의 특성상 저비용‧대용량으로 시냅스소낭 막융합을 분석할 수 있게 되었다.
아울러 기존 분석 시스템으로 규명된 내용 중에서 분석시스템(신경세포 및 합성리포좀)간에 상반된 결과를 보인 내용을 중심으로 재검증을 실시하였다. 그 결과 왜 서로 다른 분석시스템에서 각각 다른 결과가 도출되었는지 실험적으로 증명할 수 있었다. 즉 본 분석시스템을 이용하여 기존 연구결과를 재검증할 수 있음은 물론 기존의 분석시스템이 밝혀내지 못했던 새로운 내용을 밝힐 수 있음을 제안하였다.
또한 시냅스 스네어 단백질에 의해서 매개되는 액포막융합은 시냅스소낭 막융합의 억제물질인 보톡스(보툴리늄 독소)에 의해 억제됨을 관찰하였다. 이는 형질전환 효모에서 분리된 액포간의 막융합이 시냅스 스네어 단백질에 의해 매개됨을 입증하는 동시에, 본 분석시스템이 현재 통증치료와 미용치료에 널리 이용되는 보톡스의 효능개선 연구 및 보톡스 대체물질 개발 연구에 활용될 수 있음을 시사한다.
3. 기대효과
본 연구에서는 다양한 신경관련 현상의 기반이 되는 신경전달을 매개하는 시냅스소낭 막융합을 분석할 수 있는 분석시스템을 개발하였다. 이를 이용하여 시냅스소낭 막융합 과정의 분자적 작동기전 규명에 기존 분석시스템과 상호보완적으로 활용될 수 있을 것이며, 시냅스소낭 막융합 억제물질인 보톡스의 효능개선 연구 또는 고가의 보톡스를 대체할 수 있는 신물질 개발연구 등에 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.
연 구 결 과 문 답
이번 성과 뭐가 다른가
신경세포 및 동물모델(고비용, 저효율)을 이용하거나 합성 리포좀(인공물질, 재현성 미흡)에 의존하였던 기존 시냅스소낭 막융합 분석법의 한계를 극복하고 상호보완적으로 이용할 수 있는 신개념의 시냅스소낭 막융합 분석법을 개발하였음
어디에 쓸 수 있나
시냅스소낭 막융합 과정의 분자적 기전을 저비용/고효율/대용량으로 분석할 수 있고 시냅스소낭 막융합 억제물질인 보톡스 같은 신물질(저분자 화합물, 펩타이드, 천연물 등) 발굴 등에 활용될 수 있음
실용화까지 필요한 시간은
현재 상태로 보톡스 대체물질 발굴 연구 등에 활용될 수 있고 발굴된 신물질은 수년 내에 화장품 등의 유효성분으로 활용될 수 있을 것으로 기대함. 약물로서의 이용은 발굴된 물질의 특성 및 종류에 따라 실용화 소요시간이 가변적임
실용화를 위한 과제는
대용량(high throughput) 분석 포맷 확립을 위한 최적화 연구가 필요하다고 사료됨
연구를 시작한 계기는
시냅스소낭 막융합 연구 중, 기존 분석시스템의 한계를 절감하고 이를 극복 또는 보완할 수 있는 새로운 분석시스템의 개발이 절실하다고 판단되어 시작하였음
에피소드가 있다면
인간 신경세포에 존재하는 시냅스소낭 및 신경세포막에 발현하는 시냅스 스네어(SNARE)를 효모의 액포에 발현시키는 것이 관건이었는데, 반복연구를 통해서 운이 좋게도 해결할 수 있었음
꼭 이루고 싶은 목표는
시냅스소낭 막융합에 관여하는 모든 인자를 포함하고 이를 통해 막융합이 일어나는 효모의 액포를 제작하여 시냅스소낭 다이나믹스의 전과정을 시험관에서 재현해 내고 싶음
그림 1. 형질전환 효모의 액포를 이용한 시냅스소낭 막융합 분석시스템 모식도
(왼쪽) Syntaxin(보라색)과 SNAP25(노란색)를 발현하도록 제작한 효모의 액포(pretease라고 표기된 회색 구)는 단백질 분해효소(protease)를 포함하고 있고, Synaptobrevin(녹색)을 발현하는 효모의 액포(pro-ALP라고 표기된 회색 구)는 알칼리성 탈인산화효소의 전구체(pro-alkaline phosphatase, pro-ALP)를 포함하고 있다.
(가운데) 이들 액포를 서로 섞어주면 Syntaxin/SNAP25와 Synaptobrevin간 trans-SNARE complex가 형성되면서 (오른쪽) 액포 간의 막융합(membrane fusion)이 일어난다.
(아래) 막융합으로 두 액포의 내용물이 섞이면 단백질분해효소에 의해 알칼리성 탈인산화효소가 활성화되는데 이때 활성화된 효소가 기질인 pNpp(무색)를 pNp(노란색)로 바꾸는 정도를 측정하면 두 액포 간의 막융합을 정량적으로 측정할 수 있게 된다.
그림 2. 보톡스에 의한 시냅스 스네어에 의한 액포막융합 반응의 억제 효과
(a) 시냅스소낭 막융합 억제물질인 보톡스를 넣어주면 농도와 비례하여 액포막융합을 억제한다. 온도가 낮은 조건(Ice)에서는 막융합이 일어나지 않지만 27°C에서는 일정 수준의 막융합이 일어나는데 이 때 보톡스 농도를 점차 증가시키면 농도에 비례하여 막융합이 억제된다. 1mM에서는 막융합이 거의 일어나지 않았다. 대조군으로 사용한 시냅스소낭 막융합의 억제인자로 알려진 Synaptobrevin의 세포질쪽 도메인 및 인지질 리간드인 MED에 의해서도 막융합이 억제됐다.
(b) 보톡스에 의한 막융합 억제효과가 실제 시냅스 스네어(SNAP25)의 분해 때문임을 관찰하였다. 막융합 반응 후 반응물 전체를 단백질 전기영동법에 의해 분리시킨 후 면역블로팅 기법을 통해 SNAP25의 분해여부를 확인하였다. 보톡스를 첨가했을 때 잘려져 크기가 작아진 SNAP25가 있음을 확인할 수 있었다. Pep4p 단백질은 각 샘플에 비슷한 양의 단백질이 존재하고 있음을 보여주는 대조군으로 사용되었다.
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