- KAIST-IBS, 림프관 만드는 단백질의 3차원 구조와 신호 증폭 원리 밝혀
- 림프부종 치료부터 암 전이 억제까지… 림프관 관련 난치성 질환의 새로운 치료제 개발 실마리 제공

림프관은 몸속에 고인 체액을 거두는 ‘배수로’다. 림프관이 부족하거나 제 기능을 못 하면 팔다리가 붓는 림프부종이 생길 수 있고, 종양 주변에 지나치게 늘어나면 암세포가 퍼지는 통로가 될 수 있다. 한국 연구진은 림프관을 만드는 단백질들이 짝을 이룬 뒤 다시 서로 모여 신호를 키운다는 사실을 밝혀냈다. 이 모임을 조절하는 방식이 림프관 생성 신호를 높이거나 낮출 치료 전략을 연구하는 데 단서가 될 것으로 기대된다.

KAIST(총장 배충식)는 생명과학과 김호민 교수와 기초과학연구원(IBS·원장 장석복) 이상규 박사 공동 연구팀이 림프관 생성에 관여하는 단백질 ‘VEGF-C’와 그 신호를 받아들이는 수용체 ‘VEGFR-3’의 결합 구조를 규명하고, 이들이 모여 신호를 증폭하는 원리를 확인했다고 2일 밝혔다.

VEGF-C가 세포 표면의 VEGFR-3에 결합하면 수용체가 활성화되고, 림프관의 형성과 기능을 조절하는 신호가 세포 안으로 전달된다. 지금까지는 이 과정에서 VEGFR-3 수용체 두 개가 짝을 이루는 것이 활성화의 핵심 단계로 알려져 있었다. 그러나 그 뒤 신호가 어떻게 더 강해지는지는 충분히 밝혀지지 않았다.

연구팀은 단백질의 입체적인 모습을 자세히 볼 수 있는 초저온전자현미경으로 VEGF-C와 VEGFR-3가 결합한 구조를 살펴봤다. 그 결과, 수용체 두 개가 짝을 이뤄 만든 복합체들이 다시 옆으로 맞물린 구조를 확인했다. 이는 복합체들이 세포막을 따라 나란히 모이는 새로운 구조적 방식을 보여준다.

쉽게 말해 두 사람이 짝을 이뤄 일을 시작한 뒤, 여러 팀이 모여 힘을 더하는 것과 같다. 연구팀은 실제로 이 모임이 신호를 키우는지도 실험했다. 복합체끼리 맞닿는 부위를 바꾸거나 빛을 이용해 수용체가 모이도록 조절한 결과, 여러 복합체가 모이는 과정이 신호 증폭에 중요하다는 사실을 확인했다.

이번 연구는 림프관 생성 신호를 조절할 새로운 지점을 제시한다. 앞으로 림프관 생성이 부족한 경우에는 신호를 높이고, 종양 주변에 림프관이 과도하게 만들어지는 경우에는 신호를 낮추는 방법을 연구할 수 있다. 다만 이번 연구에서 림프부종 치료나 암 전이 억제 효과를 확인한 것은 아니며, 실제 치료에 적용하려면 추가 연구가 필요하다.

김호민 교수는 “이번 연구는 림프관 생성 신호를 받는 수용체 두 개가 짝을 이룬 뒤, 이렇게 만들어진 여러 짝이 다시 모여 신호를 더 강하게 만든다는 원리를 밝혀낸 것”이라며 “그동안 보이지 않았던 림프관 생성 신호의 ‘숨은 증폭 스위치’를 찾아낸 만큼, 향후 림프부종과 암 전이 등 관련 질환의 새로운 치료 전략을 세우는 데 중요한 기반이 될 것”이라고 말했다.

이번 연구에는 KAIST 이노코어(InnoCORE) AI-CRED 혁신신약연구단 조령은 박사와 KAIST 생명과학과 안진숙 박사가 공동 제1저자로 참여했다. KAIST 김호민 교수와 IBS 이상규 박사는 공동 교신저자로 연구를 이끌었다. 연구 결과는 국제 학술지 ‘어드밴스드 사이언스(Advanced Science)’에 9월 9일 온라인 게재됐다.

※ 논문명: Structural basis of lymphangiogenic receptor VEGFR-3 activation mediated by distinctive clustering of the ligand–receptor complex 

이번 연구는 과학기술정보통신부 이노코어(InnoCORE) 프로그램, 한국연구재단(NRF) 중견연구자지원사업, NEXUS & CELINE 컨소시엄, KAIST 대규모 융합연구소 운영사업, 기초과학연구원 등의 지원을 받아 수행됐다.

연구 개요

□ 연구 배경
림프관은 조직에 쌓인 체액을 회수하고 면역세포의 이동을 돕는 등 우리 몸의 체액 균형과 면역 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 특히 VEGF-C와 그 수용체 VEGFR-3의 신호는 새로운 림프관이 형성되는 림프관 신생(lymphangiogenesis)과 정상적인 림프관 기능 유지에 핵심적인 역할을 한다. 이러한 신호가 제대로 조절되지 않으면 림프관 관련 질환으로 이어질 수 있다. VEGFR-3 기능이 저하되는 유전적 이상은 림프부종을 유발할 수 있으며, 반대로 VEGF-C–VEGFR-3 신호가 과도하게 활성화되면 종양 주변의 림프관 신생이 증가해 암 전이를 촉진할 수 있다. 따라서 이 신호전달 과정을 분자 수준에서 이해하는 것은 림프관 관련 질환의 새로운 치료 전략을 개발하는 데 중요하다. 지금까지는 VEGF-C가 VEGFR-3에 결합해 두 개의 수용체가 짝을 이루는 이량체화(dimerization)가 수용체 활성화의 핵심 과정으로 알려져 있었다. 그러나 이량체가 만들어진 이후 신호가 어떻게 효과적으로 증폭되는지에 대해서는 충분히 밝혀지지 않았다. 또한 VEGF-C와 결합한 사람 VEGFR-3 전체 세포외 영역의 3차원 구조도 규명되지 않은 상태였다. 이에 연구진은 초저온전자현미경 (Cryo-EM)을 이용한 분자구조 규명과 세포 기반 기능 실험을 결합해 VEGF-C와 VEGFR-3의 새로운 신호 활성화 원리를 밝히고자 했다.
    
□ 연구내용
연구진은 초저온전자현미경을 이용해 VEGF-C와 사람 VEGFR-3 전체 세포외 영역이 결합한 복합체의 3차원 구조를 최초로 규명했다. 그 결과 VEGF-C와 VEGFR-3가 이루는 기본 복합체들이 각각 따로 존재하는 것이 아니라, 다시 서로 모여 더 큰 고차 클러스터를 형성한다는 사실을 발견했다. 구조 분석 결과 VEGF-C–VEGFR-3 복합체는 옆으로 나란히 배열되는 시스(cis) 클러스터와 서로 반대 방향으로 배열되는 트랜스형 (trans-like) 클러스터의 두 가지 형태로 조립될 수 있었다. 특히 시스 클러스터 형성에는 VEGFR-3의 세포막 가까이에 위치한 D5 영역의 WTP 모티프가 중요한 결합 부위로 작용함을 밝혔다. 이 부위에 돌연변이를 도입해 시스 클러스터 형성을 방해하자 VEGF-C를 처리하더라도 VEGFR-3와 ERK의 활성화 및 AKT·ERK 하위 신호가 크게 감소했다. 반면 트랜스형 클러스터 형성을 방해한 경우에는 신호전달에 큰 변화가 없었다. 연구진은 이어 빛을 이용해 수용체의 모임을 인위적으로 조절하는 광유전학(optogenetics) 기술을 활용했다. 정상적인 시스 클러스터를 만들지 못하는 VEGFR-3도 빛으로 강제 클러스터링을 유도하자 AKT와 ERK 신호가 다시 활성화됐다. 이를 통해 VEGF-C에 의해 형성된 수용체 이량체들이 다시 고차 클러스터로 모이는 과정이 강한 VEGFR-3 신호를 만들어내는 핵심 증폭 단계임을 확인했다. 논문은 이를 기존의 ‘단량체→이량체’ 모델을 넘어서는 ‘이량체→ 클러스터(dimer-to-cluster)’ 모델로 제시했다.

□ 기대 효과
이번 연구는 VEGF-C–VEGFR-3 신호가 단순한 수용체 이량체화에서 끝나는 것이 아니라 여러 수용체 복합체가 다시 모여 신호를 증폭한다는 새로운 활성화 원리를 제시함으로써, 림프관 생성과 기능을 조절하는 분자 기전에 대한 이해를 확장했다. 또한 VEGFR-3의 클러스터 형성 부위와 3차원 구조를 제시함으로써, 향후 클러스터 형성을 강화해 림프관 기능을 높이거나 반대로 클러스터 형성을 차단해 비정상적인 림프관 신생을 억제하는 새로운 치료제 설계의 구조적 기반으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 실제 림프부종 치료나 암 전이 억제 효과를 확인하기 위해서는 동물모델을 포함한 추가 연구가 필요할 것이다.

※ 관련 동영상:
단백질샘플을 초저온 급속 냉동으로 얼리는 Cryo-EM 샘플 준비영상 : https://drive.google.com/file/d/1OGPpkzmZMaWU3oxfswpbcEtt3NzX3n4q/view?usp=drive_link
Cryo-EM 이미지 수집을 위한 그리드 선별과정 영상 : https://drive.google.com/file/d/1Bg6zEPeS9NZDO8zFaj59Fe7L_f8tBWwQ/view?usp=drive_link
Cryo-EM 장비에 얼려진 단백질샘플 로딩하는 영상 : https://drive.google.com/file/d/19c1INwek38B72KKPPXmPVTggYAoO4aY3/view?usp=drive_link
KAIST KARA에 구축된 Titan Krios Cryo-EM 장비 : https://drive.google.com/file/d/1c5Wmj44_9taYIW4N_mumg6tT21iOUYNQ/view?usp=drive_link
이번 연구에서 규명된 VEGF-C와 VEGFR-3 복합체 분자 구조 영상 : https://drive.google.com/file/d/198bcFoTb_pv__Ep-MHwcI47G4gv5yisx/view?usp=drive_link

연구 결과 Q&A

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?
처음부터 VEGFR-3의 ‘고차구조’나 클러스터링을 찾기 위해 시작한 연구는 아니었습니다.

저희는 림프부종과 같은 림프관 질환에 적용할 수 있는 새로운 치료 전략을 고민하면서, VEGFR-3를 선택적으로 활성화할 수 있는 VEGF-C mimic 단백질을 개발하고자 했습니다. 그러기 위해서는 먼저 VEGF-C가 VEGFR-3에 어떻게 결합하고 수용체를 활성화하는지를 분자 수준에서 정확히 이해할 필요가 있었습니다.

그래서 VEGF-C와 VEGFR-3의 전체 세포외영역이 결합한 복합체를 초저온전자현미경(cryo-EM)으로 관찰했는데, 예상과 달리 각각의 복합체가 따로 존재하는 것이 아니라 여러 복합체가 서로 모여 더 큰 구조를 형성하는 모습을 발견했습니다. 이 예상하지 못했던 관찰이 이번 연구의 중요한 출발점이 됐습니다.

□ 이번 연구성과의 핵심은 무엇인가?
이번 연구의 핵심은 VEGFR-3의 활성화가 단순히 두 수용체가 짝을 이루는 ‘이량체화(dimerization)’에서 끝나지 않고, 여러 VEGF-C/VEGFR-3 복합체가 다시 모여 클러스터를 형성하면서 신호가 증폭된다는 새로운 작동 원리를 밝힌 것입니다.

기존에는 VEGF-C가 두 개의 VEGFR-3를 연결해 이량체를 만들면 수용체가 활성화된다고 이해해 왔습니다. 하지만 저희는 cryo-EM을 통해 이 기본 복합체들이 다시 서로 결합해 고차 클러스터를 형성한다는 것을 직접 관찰했고, 특히 옆으로 나란히 배열되는 cis-clustering이 VEGFR-3의 강력한 신호전달에 중요하다는 것을 세포 실험으로 확인했습니다.

따라서 기존의 ‘monomer-to-dimer’ 모델을 ‘dimer-to-cluster’ 모델로 확장했다는 점이 이번 연구의 가장 중요한 의미라고 생각합니다.

□ 기존 연구·기술과 비교했을 때 차별점은?
기존에도 VEGF와 VEGFR의 여러 복합체 구조가 보고돼 있었지만, VEGFR-3의 경우에는 VEGF-C와 결합한 수용체의 일부 영역만 구조가 알려져 있었습니다. 따라서 VEGF-C의 결합이 수용체 전체의 배열을 어떻게 변화시키고, 그것이 다음 단계의 신호 활성화로 어떻게 이어지는지는 명확하지 않았습니다.

이번 연구에서는 사람 VEGFR-3의 전체 세포외영역(full ectodomain)을 포함한 VEGF-C 복합체를 cryo-EM으로 처음 규명했습니다. 그 결과 기존의 2:2 VEGF-C/VEGFR-3 복합체뿐 아니라, 이 복합체들이 다시 결합해 형성하는 cis-cluster와 trans-like cluster라는 두 가지 고차구조를 약 3.2–3.3 Å 수준에서 규명할 수 있었습니다.

또한 단순히 구조를 관찰하는 데 그치지 않고, 구조를 바탕으로 클러스터 형성을 선택적으로 방해하는 돌연변이를 만들고 세포 신호실험과 광유전학(optogenetics)을 이용해 클러스터링과 신호 활성화 사이의 인과관계까지 검증했다는 점도 중요한 차별점입니다.

□ 이번 연구에서 가장 중요한 발견은 무엇인가?
가장 중요한 발견을 하나 꼽는다면, VEGFR-3의 D5 영역에 있는 ‘WTP motif’가 여러 VEGF-C/VEGFR-3 복합체를 옆으로 연결해 cis-cluster를 형성하는 핵심 부위라는 사실을 발견한 것입니다.

이 WTP motif를 변형해 cis-cluster가 만들어지지 않도록 하자, VEGF-C가 존재하더라도 VEGFR-3 자체의 인산화와 하위의 AKT·ERK 신호가 크게 감소했습니다. 반대로 광유전학적 방법으로 수용체들을 인위적으로 다시 모아주면 이러한 신호결함이 회복됐습니다. 즉, 수용체가 단순히 두 개씩 짝을 이루는 것만으로는 충분하지 않고, 그 이후의 클러스터링이 강한 신호를 만들어내는 일종의 ‘증폭 스위치’ 역할을 한다는 것을 보여준 것입니다.

또 하나 흥미로운 발견은 서로 반대 방향으로 배열되는 trans-like cluster입니다. 매우 독특한 구조이지만, 현재의 세포 실험에서는 VEGF-C에 의한 일반적인 신호 활성화에 필수적이지 않은 것으로 나타났습니다. 따라서 이 구조가 실제 림프관 조직에서 어떤 역할을 하는지는 앞으로 규명해야 할 중요한 연구과제입니다.

□ 연구 과정에서 가장 어려웠던 점은?
가장 어려웠던 점은 cryo-EM에서 관찰한 고차구조가 단순히 고농도의 정제 단백질에서 생긴 현상인지, 아니면 실제 VEGFR-3 신호전달과 관련된 기능적인 구조인지 구분하는 것이었습니다.

실제로 저희가 처음 cryo-EM 이미지에서 긴 사슬 형태의 구조를 봤을 때는 비특이적인 단백질 응집일 가능성도 배제할 수 없었습니다. 그래서 농도에 따른 복합체 형성을 분석하고, 희석했을 때 다시 작은 복합체로 되돌아가는 가역성을 확인해 무작위 응집과 구별했습니다.

그다음에는 구조에서 예측한 접촉면을 선택적으로 변형해 cis-와 trans-like cluster를 각각 깨뜨리고, 웨스턴 블롯과 실시간 세포 이미징을 이용해 VEGFR-3, AKT, ERK 신호가 어떻게 달라지는지를 확인했습니다. 그 결과 cis-clustering interface를 방해하면 VEGF-C에 의한 신호전달이 현저히 감소하는 반면, trans-like interface를 방해한 경우에는 큰 변화가 없다는 것을 확인했습니다.

따라서 구조적으로 흥미로운 현상을 발견하는 것에서 그치지 않고, 그 구조가 실제 신호전달에 어떤 의미를 갖는지를 기능적으로 연결하는 과정이 이번 연구에서 가장 중요하면서도 어려운 부분이었습니다.

□ 응용 가능 분야는?
이번 연구는 VEGFR-3 신호를 보다 정밀하게 조절하는 새로운 치료제 개발에 활용될 수 있습니다.

예를 들어 림프관 기능을 높여야 하는 림프부종과 같은 질환에서는 VEGFR-3의 cis-clustering을 촉진해 신호를 증폭시키는 agonist를 개발할 수 있습니다. 반대로 암과 같이 과도한 림프관 신생을 억제해야 하는 경우에는 cis-clustering interface를 차단해 VEGFR-3 신호 증폭을 막는 inhibitor를 개발하는 전략을 생각할 수 있습니다.

기존 치료제가 주로 VEGF-C와 VEGFR-3의 결합 자체를 차단하는 방식에 초점을 맞췄다면, 이번 연구는 그 다음 단계인 ‘수용체 클러스터링’을 새로운 치료 표적으로 제시했다는 점에서 의미가 있습니다. 논문에서도 D5 영역의 clustering interface를 막는 ‘cluster-breaker’ 또는 반대로 clustering을 유도하는 ‘molecular staple’ 개념을 새로운 치료 전략으로 제안했습니다.

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? (실용화 계획 포함)
실용화 측면에서는 이번에 규명한 고해상도 구조를 일종의 ‘설계도’로 활용해 VEGFR-3의 클러스터링을 선택적으로 조절하는 단백질이나 항체 치료제를 개발할 수 있습니다.

특히 단순히 VEGF-C 결합 부위를 막는 것이 아니라, 이번 연구에서 발견한 cis-clustering interface를 선택적으로 차단하는 항체나 de novo mini-binder, 또는 반대로 여러 VEGFR-3를 적절한 거리와 방향으로 모아주는 agonist 단백질을 설계하는 것이 가능합니다.

후속 연구에서는 이러한 구조 정보를 AI 기반 단백질 설계 기술과 결합해 후보물질을 제작하고, 세포 수준의 신호 활성 조절 효과를 검증한 뒤 림프부종이나 종양 림프관 신생 동물모델에서 효능과 안전성을 평가하는 방향으로 발전시키고자 합니다. 논문에서도 clustering interface를 정밀하게 표적하는 항체 및 de novo mini-binder 개발을 향후 치료제 개발 방향으로 제시했습니다.

□ 기대효과와 향후 계획은?
이번 연구를 통해 VEGFR-3 활성화에 대해 ‘리간드 결합 → 이량체화 → 클러스터링 → 신호 증폭’이라는 새로운 관점을 제시할 수 있었습니다. 이는 VEGFR-3뿐 아니라 다른 수용체 단백질들이 세포막에서 어떻게 공간적으로 조직되어 신호의 세기와 지속시간을 조절하는지를 이해하는 데도 중요한 단서가 될 수 있습니다.

앞으로는 먼저 cis-clustering이 실제 림프관 내피세포와 생체 조직에서 언제, 어디서, 어느 정도 규모로 형성되는지를 규명할 필요가 있습니다. 또한 이번에 구조적으로 발견했지만 기능이 아직 명확하지 않은 trans-like clustering의 생리적 역할, 그리고 Neuropilin-2와 같은 보조수용체가 이러한 고차구조를 어떻게 조절하는지도 중요한 후속 연구과제입니다. 논문에서도 현재 구조 연구와 HEK293T 세포실험만으로는 native VEGFR-3 cluster의 정확한 stoichiometry와 생체 내 역할까지 확정할 수 없다는 한계를 명시하고 있습니다.

궁극적으로는 이러한 구조적·기능적 이해를 바탕으로 VEGFR-3 신호를 필요에 따라 켜거나 끌 수 있는 정밀 치료제를 개발해, 림프부종과 같은 림프관 기능저하 질환부터 암의 림프관 신생과 전이까지 서로 반대 방향의 질환을 선택적으로 조절하는 것이 목표입니다.