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한빛사논문

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장홍제
장홍제Hongje Jang

UC San Diego

Nat. Methods, 2023 Mar;20(3):448-458 | https://doi.org/10.1038/s41592-023-01779-1 Super-resolution SRS microscopy with A-PoD

Hongje Jang 1, Yajuan Li1, Anthony A. Fung1, Pegah Bagheri 1, Khang Hoang1, Dorota Skowronska-Krawczyk 2, Xiaoping Chen3, Jane Y. Wu3, Bogdan Bintu1 & Lingyan Shi 1

1Shu Chien - Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA. 
2School of Medicine, University of California, Irvine, CA, USA. 
3The Ken and Ruth Davee Department of Neurology, Northwestern University, Chicago, IL, USA.

Corresponding author : Correspondence to Lingyan Shi.

Abstract

Stimulated Raman scattering (SRS) offers the ability to image metabolic dynamics with high signal-to-noise ratio. However, its spatial resolution is limited by the numerical aperture of the imaging objective and the scattering cross-section of molecules. To achieve super-resolved SRS imaging, we developed a deconvolution algorithm, adaptive moment estimation (Adam) optimization-based pointillism deconvolution (A-PoD) and demonstrated a spatial resolution of lower than 59 nm on the membrane of a single lipid droplet (LD). We applied A-PoD to spatially correlated multiphoton fluorescence imaging and deuterium oxide (D2O)-probed SRS (DO-SRS) imaging from diverse samples to compare nanoscopic distributions of proteins and lipids in cells and subcellular organelles. We successfully differentiated newly synthesized lipids in LDs using A-PoD-coupled DO-SRS. The A-PoD-enhanced DO-SRS imaging method was also applied to reveal metabolic changes in brain samples from Drosophila on different diets. This new approach allows us to quantitatively measure the nanoscopic colocalization of biomolecules and metabolic dynamics in organelles.

논문정보

관련 인터뷰

1. 논문관련 분야의 소개, 동향, 전망을 설명, 연구과정에서 생긴 에피소드 이번 연구는 새로운 image deconvolution 알고리즘인 Adam-based Pointillism Deconvolution (A-PoD)을 stimulated Raman scattering (SRS)와 결합시킨 이미징 플랫폼입니다. SRS는 분자 지문을 검출하는 강력한 능력을 가지고 있으며, A-PoD는 이미지의 해상도를 월등히 높여줄 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 분자 구조에 따라 다양하게 변하는 Raman spectrum을 기반으로, SRS는 특정 분자 분포를 시각화할 수 있습니다. 또한 세포와 동물에 중수(重水: Heavy Water)를 제공하여 여러 종류의 biomolecule에 결합된 중수소의 vibration을 이용하여 대사 활동을 시각화할 수 있었습니다. 이러한 측정 방법은 지도교수님이신 Dr. Lingyan Shi에 의하여 개발되었으며, 생체 내의 anabolic activity를 측정할 수 있는 중요한 도구가 되고 있습니다. 이 방법으로 측정된 분자의 나노미터 단위 분포를 개선하고 드러내기 위해 A-PoD가 적용되었습니다. A-PoD는 모든 신호가 불연속적으로 분포되어있는 점 방출체에서 발생하는 것으로 가정합니다. 그리고, 이 프로그램은 SRS 현미경의 광학적 특성을 나타내는 함수 (Point spread function)를 정의하고 제한된 수의 점의 위치를 최적화하여 더 높은 해상도의 이미지를 생성합니다. 이 과정은 실제 분자 분포의 성질을 모방하는 방식과 비슷하며, 이 방식으로 diffraction limited image의 해상도를 효율적으로 향상시킬 수 있습니다. 이 방법은 더욱 폭넓은 방향으로 일반적인 사진 및 의료용 이미지 개선에도 사용될 수 있습니다. 이렇게 결합된 A-PoD - SRS 현미경을 단일 세포부터 인간 망막 조직 및 동물 장기까지 다양한 유형의 샘플에 적용했습니다. 특히, 단일 지질 방울과 세포막을 시각적으로 분리했습니다. HEK 세포 실험에서는 단백질, 지질 및 미토콘드리아 막 채널의 공존 이미지를 측정했습니다. SRS 현미경을 사용하여 단백질 및 지질 신호를 감지하고 형광 단백질로 미토콘드리아 막을 표시하여 일반적으로 공존하는 막 구성요소와 분리된 막 구성요소를 구분했습니다. 인간 망막 조직에서는 망막 표면의 막세포를 관찰했습니다. 공간 해상도가 개선되어 디콘볼루션 후 세포의 막 구성요소를 시각화할 수 있었습니다. 과다한 포도당 조건에서 Drosophila 뇌 이미지에서는 식이 조절 지질 대사 변화를 측정했습니다. 지질 대사 활동이 증가했습니다. 정확한 크기 정보를 기반으로 두 가지 식이 조건에서 지질 방울의 에너지 변동도 측정했습니다. 해상도 개선으로 인해 지질 방울 내 신규 합성 지질의 불균일한 분포가 측정되었습니다. 2. 연구를 진행했던 소속기관 또는 연구소에 대해 소개 부탁드립니다. UC San Diego Bioengineering department에서는 Bioinformatics와 함께 tissue engineering과 Biomechanics, 그리고 그 밖의 다양한 기술을 융합한 폭넓은 연구를 진행하고 있습니다. 현재 저는 Lingyan Shi 교수님 연구실에서 박사후 연구원으로 일하고 있으며, 이 곳에서 Raman scattering을 이용한 hyperspectral imaging을 효율적으로 응용할 방법을 연구중이며, spectrum에 대한 이론적인 분석을 바탕으로 Raman 현미경의 정확도와 활용 범위를 넓히는 작업을 진행하고 있습니다. 3. 연구 활동 하시면서 평소 느끼신 점 또는 자부심, 보람 현재 제가 속한 Bioengineering department의 연구 분야를 소개할 때 사람들이 항상 많이 사용하는 단어가 interdisciplinary입니다. 저는 화학을 공부하기 시작해서 물리화학과 현미경을 공부하고, 박사과정에서는 물리와 이미지 분석 알고리즘을 공부했습니다. 그리고 지금은 그 모든 내용을 통합할 수 있는 분과에서 연구를 진행하고 있습니다. 앞으로도 필요에 따라서 연구 배경을 넓혀갈 것이며, 그런 의지를 가지고 있다는 점에서 항상 자부심을 느낍니다. 4. 이 분야로 진학하려는 후배들 또는 유학준비생들에게 도움이 되는 말씀을 해 주신다면? A-PoD의 이름을 정할 때, 처음 deconvolution program에 대한 아이디어를 얻은 순간을 떠올렸습니다. 미술관에서 한 점묘화를 보던 중 ‘이 그림의 구성은 분자 분포를 닮았다.’라는 생각을 했고, 그 순간 그 생각에 이어 점묘화의 방식을 따라한 image deconvolution program을 생각해냈습니다. 아쉽게도 같은 아이디어에 바탕을 둔 SUPPOSe가 조금 먼저 나오긴 했지만, 조금 더 실용적이고 높은 성능을 발휘하는 프로그램을 만들겠다는 마음에서 한단계 성능이 더 좋은 A-PoD을 만들게 되었습니다. 그리고, 가장 강력한 성능을 발휘할 수 있는 조건인 Raman imaging에 적용한 것 또한 중요한 과정이라 생각합니다. 따라서, 먼저 앞으로 공부할 후배들에게는 모든 활동을 연구와 연결시킬 수 있는 집중력과 응용력이 중요하다는 것을 이야기해주고 싶습니다. 그리고, 조금이라도 더 나은 결과를 만들기 위해서 해온 노력들이 위험한 순간에서 벗어날 수 있는 기회로 작용할 것이라는 것과 언제나 그 진가를 발휘할 수 있는 때와 장소를 찾는 것 또한 중요하다는 것을 이야기하고 싶습니다. 5. 연구 활동과 관련된 앞으로의 계획이 있으시다면? 앞으로, 이미 개발된 A-PoD coupled SRS microscopy의 활용 범위를 넓혀가는 것을 우선으로 생각하고 있습니다. 그 외에도 이와 관련하여 SRS 현미경의 실용성을 더 높이는 작업을 진행할 계획이며, 먼 미래에는 SRS와 조금 상관없어보이는 현미경 이미지들과 SRS 이미지들간의 상호관계를 밝혀내는 과정 또한 생각중입니다. 6. 다른 하시고 싶은 이야기들..... A-PoD coupled SRS microscopy는 시각화할 수 있는 분자의 종류와 반응의 종류를 고려하면, 그 잠재력이 아주 큰 연구 분야입니다. 생물학의 다양한 분야에서 사람들이 편하게 사용하도록 조금 더 나은 기술 개발을 위해 힘쓰겠습니다.
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