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한빛사논문

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김경록
김경록Kyung Lock Kim

POSTECH

Nat. Commun., Published 24 March 2016, 7, Article number: 11107 | doi:10.1038/ncomms11107 Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting

Abstract

Kyung Lock Kim1, Daehyung Kim2, Seongsil Lee3, Su-Jeong Kim1, Jung Eun Noh1, Joung-Hun Kim1, Young Chan Chae1, Jong-Bong Lee2,3 & Sung Ho Ryu1,3

1 Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), Pohang 790-784, Republic of Korea. 2 Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), Pohang 790-784, Republic of Korea. 3 School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), Pohang 790-784, Republic of Korea.

Correspondence to : Sung Ho Ryu
 
Abstract
Post-translational modifications (PTMs) of receptor tyrosine kinases (RTKs) at the plasma membrane (PM) determine the signal transduction efficacy alone and in combination. However, current approaches to identify PTMs provide ensemble results, inherently overlooking combinatorial PTMs in a single polypeptide molecule. Here, we describe a single-molecule blotting (SiMBlot) assay that combines biotinylation of cell surface receptors with single-molecule fluorescence microscopy. This method enables quantitative measurement of the phosphorylation status of individual membrane receptor molecules and colocalization analysis of multiple immunofluorescence signals to directly visualize pairwise site-specific phosphorylation patterns at the single-molecule level. Strikingly, application of SiMBlot to study ligand-dependent epidermal growth factor receptor (EGFR) phosphorylation, which is widely thought to be multi-phosphorylated, reveals that EGFR on cell membranes is hardly multi-phosphorylated, unlike in vitro autophosphorylated EGFR. Therefore, we expect SiMBlot to aid understanding of vast combinatorial PTM patterns, which are concealed in ensemble methods, and to broaden knowledge of RTK signaling.

논문정보

관련 인터뷰

1. 논문관련 분야의 소개, 동향, 전망을 설명, 연구과정에서 생긴 에피소드 Post-translational modifications(PTMs)에 관해서는 이미 수없이 많은 연구에서 다뤄지고 따로 설명이 필요없을만큼 생물학에서 빈번하게 언급되는 조절 기작입니다. 특히, Human Genome Project이후, 예상보다 적은 제한된 숫자의 유전자로 다양한 신호전달을 수행하기 위한 여러 기작 중에서 PTMs은 아주 크게 기여하고 있습니다. 현재까지 알려진 PTM sites만도 유전자 숫자보다 3~4배 이상 많이 있으며, High-Throughput Assay 기술의 발전에 따라 기하급수적으로 증가하고 있습니다. 따라서 하나의 유전자로부터 유래한 신호전달 단백질이 다수의 PTM sites를 가지고 있는 경우가 일반적입니다. 이러한 신호전달 단백질에서 각각의 PTM sites의 상태에 따른 조합에 따라 다양한 기능을 수행할 것이라고 오래전부터 많은 연구자들이 생각하고 있습니다. 대표적으로 Epigenetics에서 Histone Code Hypothesis로서, Combinatorial Histone Modification에 따른 Chromatin Remodeling과 Transcription Regulation에 관여할 것이라는 학설입니다. 하지만 이러한 Combinatorial PTMs Pattern에 관한 오랜 관심에 비하여, 기존의 연구 방법은 분자들의 집합체 수준에서 연구함으로써 Ensemble Error로 인하여 정확한 연구가 불가능했습니다. 최근 Single-Molecule 수준에서의 연구가 발달함에 따라, 저희는 Combinatorial PTM Pattern에 Single-Molecule Imaging을 접목하였고, 첫 사례로 EGFR activation기전을 연구하였습니다. 비록 이번 연구에서는 EGFR만 보고를 하였지만, 아직 많은 combinatorial PTMs pattern을 가진 중요한 신호전달 단백질이 많은 만큼 연구할 것들이 많이 있습니다. 그리고 기술의 발전만큼 미지의 영역이었던 Combinatorial PTM에 관한 연구가 활성화 될 것이라고 기대합니다. 연구 과정 중에 에피소드는, 기존의 많은 연구자들과 마찬가지로 저희 역시 처음에 EGFR phosphorylation을 연구하면서 당연히 EGFR은 multi-phosphorylation이 될 것이라고 생각하였습니다. 따라서 Cell에서 EGFR phosphorylation pattern이 mono-phosphorylation으로 나타나는 것을 처음 확인하였을 때, 새로운 발견의 기쁨보다는 실험이 잘못되었다고 생각하고 좌절하였습니다. 몇 일을 실의에 빠져있다가, In vitro autophosphorylation을 통해 인위적인 multi-phosphorylated EGFR을 만들어 실험이 잘못된 것이 아니라, 실제로 EGFR이 mono-phosphorylation으로 존재하고 있다는 것을 확인하였습니다. 그 이후에야, 안심의 한숨을 내쉴 수 있었습니다. 아무도 확인하지 않았던 사실이지만 기존 학설에 관한 선입견을 벗어던지는 것은 어려운 일임을 몸소 체험할 수 있었습니다. 2. 연구를 진행했던 소속기관 또는 연구소에 대해 소개 부탁 드립니다. 포스텍 신호전달연구실에서는 mTOR나 세포막 수용체들과 같이 세포들간의 communication과 질병 과정에서 중요한 신호전달단백질들에 대한 정체와 작동원리를 밝히는 연구를 진행하고 있으며, 이들을 제어해서 암이나 당뇨와 같은 질환의 이해와 치료를 위한 기초정보와 물질 개발에 노력하고 있습니다. 3. 연구활동 하시면서 평소 느끼신 점 또는 자부심, 보람 Steve Jobs를 좋아하진 않지만, 그의 말을 인용하자면 'Connecting the Dots'라고 하지요. 학위 과정 중에 수많은 실패와 흥미없는 주제들로 가득차 있었는데, 마지막에 그 모든 '무의미한 점들'을 이을 수 있는 '선'을 찾은 것 같다는 것이 가장 큰 보람과 자부심을 느끼는 것 같습니다. 그리고 아무도 도와주지 않던 시기에 홀로 걷는 동안 많이 외로웠는데, 지금은 옆을 돌아보면 함께 도와주는 여러 사람들이 있어서 고맙고 감사합니다. 4. 이 분야로 진학하려는 후배들 또는 유학준비생들에게 도움이 되는 말씀을 해 주신다면? 여전히 Combinatorial PTMs에 관한 연구 방법은 한계가 많기 때문에 기술 개발에 관심있으신 분들에게도 좋은 기회가 될 것이라고 생각됩니다. 또한 Combinatorial PTMs 연구는 그러한 연구 방법의 한계로 인하여 숨겨져 있던 것들이 많이 존재하고, 기존의 연구 결과도 다시 볼 필요가 있습니다. Combinatorial PTMs에 관하여 Top-down Mass-based proteomics기술을 활용해서 연구하시는 분들은 일부 계시지만, 여전히 해결하지 못한 많은 한계를 가지고 있습니다. 그리고 Single-Molecule Imaging을 이용해 연구하는 분들은 거의 없는 관계로 다른 분야에 비해 도전적이지만 그만큼 좋은 기회가 많을 것이라 생각됩니다. 그리고 Genomics 뒤에는 항상 Proteomics가 뒤따랐습니다. 어쩌면, Next-Generation Sequencing 다음은 또 다른 Single-molecule을 이용한 Proteomics가 이어지지 않을까하고 생각됩니다… 5. 연구활동과 관련된 앞으로의 계획이 있으시다면? 현재의 Single-Molecule Blotting은 Single-Molecule Imaging만 할 수 있다면, 비교적 쉽고 간단하게 할 수 있는 반면에, Pairwise Detection만이 가능하고, 여러가지 문제점들을 내포하고 있습니다. 화학과와의 공동연구를 통하여, 좀 더 정확하고, 정밀하게 Single-Molecule Level에서 Combinatorial PTMs를 분석 가능한 기술을 개발하고자 합니다. 그래서 개발한 기술과 여러 기존 생물학 분야의 연구자들과 공동연구를 통해 다양한 신호전달을 연구하고자 합니다. 6. 다른 하시고 싶은 이야기들.... 오랜시간 지도 교수님이신 류성호 교수님과 지금은 UNIST로 옮기셨지만 Joint Lab으로 같이 지도해주셨던 서판길 교수님께 감사의 인사를 전합니다. 그리고 잊혀질 뻔한 이 일을 하도록 권해주었던 이성실 박사와 본인 일도 바쁘면서도 후배 논문 살펴준다고 고생한 채영찬 박사, 현미경 셋업과 촬영관련해서 도와주었던 대형이랑 수정씨한테도 고맙다는 말을 전합니다. 다급하게 찾아온 저를 다독이며, 논문부터 진로까지 같이 고민해주신 이종봉 교수님과, 항상 응원해주시고, 아낌없이 지원해 주시는 박경민 박사님과 김기문 교수님께도 감사의 인사를 드립니다. 마지막으로 마음고생 많이 하신 저희 어머님과 하늘에 계신 아버님께 감사드립니다. 더 좋은 결과로 보답할 수 있도록 노력하겠습니다.
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  • Bio통신원
  • 2016. 04. 01
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