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김진현
김진현Jinhyun Kim

Howard Hughes Medical Institute, 현 한국과학기술연구원(KIST)

Nat. Methods, 9, 96-102 (2012) | Published online 04 December 2011, doi:10.1038/nmeth.1784 mGRASP enables mapping mammalian synaptic connectivity with light microscopy

Abstract

Jinhyun Kim1,2,5, Ting Zhao1,3,5, Ronald S Petralia4, Yang Yu1, Hanchuan Peng1, Eugene Myers1 & Jeffrey C Magee1

1Janelia Farm Research Campus, Howard Hughes Medical Institute, Ashburn, Virginia, USA. 2Center for Functional Connectomics, Korea Institute of Science and Technology, Seoul, Korea. 3Qiushi Academy for Advanced Studies, Zhejiang University, Hangzhou, China. 4National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA. 5These authors contributed equally to this work. Correspondence should be addressed to J.K. and J.C.M.

The GFP reconstitution across synaptic partners (GRASP) technique, based on functional complementation between two nonfluorescent GFP fragments, can be used to detect the location of synapses quickly, accurately and with high spatial resolution. The method has been previously applied in the nematode and the fruit fly but requires substantial modification for use in the mammalian brain. We developed mammalian GRASP (mGRASP) by optimizing transmembrane split-GFP carriers for mammalian synapses. Using in silico protein design, we engineered chimeric synaptic mGRASP fragments that were efficiently delivered to synaptic locations and reconstituted GFP fluorescence in vivo. Furthermore, by integrating molecular and cellular approaches with a computational strategy for the three-dimensional reconstruction of neurons, we applied mGRASP to both long-range circuits and local microcircuits in the mouse hippocampus and thalamocortical regions, analyzing synaptic distribution in single neurons and in dendritic compartments.

논문정보

  • 형식Research article
  • 게재일2011년 12월 (BRIC 등록일 )
  • 연구진국내(교신)+국외 연구진
  • 분야
  • 피인용횟수120회 이상 인용된 논문 (상위피인용논문 등록일 2019-12-24)

관련 보도자료

뇌(腦)의 지도를 그리다...기능커네토믹스센터 김진현 박사팀, 포유류 신경망 맵핑 기술 개발 신경망을 지도화 하는 기술은 뇌 과학자들이 오랜 기간 동안 풀지 못한 숙제였다. 국내 연구진이 인간과 같은 포유동물의 복잡한 뇌의 신경망을 지도화 하는 신기술을 개발해 마침내 그 숙제를 풀었다. 교육과학기술부(장관 이주호)와 한국과학기술연구원(KIST, 원장 문길주)은 기능커넥토믹스WCI센터 김진현 박사팀이 미국 Janelia Farm Research Campus(Howard Hughes Medical Institute) 연구진과 공동연구를 통해 신경망 맵핑 기술을 개발했다고 밝혔다. * 세계수준의 연구센터(WCI: World Class Institute) 뇌 내의 신경세포들은 서로 신호를 주고받음으로서 감정, 학습, 기억, 행동, 판단 등의 중요한 기능을 수행한다. 이러한 신경세포들 간의 연결성은 뇌가 정상적으로 기능하는데 주요한 요소이기 때문에, 지난 한 세기동안 수많은 신경과학자들이 뇌 내 신경세포 간의 연결성을 규명하기 위해 많은 노력을 해왔다. 하지만 기존의 두 신경세포 간의 전기신호를 측정하는 방법으로 수천 개에서 수백억 개의 신경세포가 복잡하게 얽혀있는 뇌를 연구한다는 것은 한계가 있다. 그래서 한 번에 여러 개의 세포를 동시에 관찰할 수 있는 영상기술로 복잡한 신경망을 연구하고 있는데, 신경망 영상화는 광자(빛)를 사용하는 광학현미경과 전자를 사용하는 전자현미경을 통해 가능하다. 그런데, 광학현미경으로는 물리적 해상도의 제한으로 20nm 간격으로 연결된 신경 전달위치, 시냅스(synapse)를 정확히 관찰할 수 없다. 또한, 전자현미경으로도 시냅스 관찰은 가능하나 시간과 노력이 지나치게 소요된다는 단점이 있다. 실제로 2002년 노벨 생리의학상을 수상한 Sydney Brenner 박사는 300여개의 신경세포를 갖고 있는 선충(지렁이, C. elegans)의 신경망을 전자현미경으로 지도화 하는데 20년을 투자한 바 있다. 김 박사팀은 20nm 간격의 시냅스를 광학현미경으로 비교적 쉽게 찾아낼 수 있는 mGRASP(mammalian GFP Reconstitution Across Synaptic Partners) 기술을 개발해 이러한 문제를 해결했다. mGRASP 기술은 최근 생명공학계에서 널리 쓰이는 녹색형광물질(GFP)을 두 분자로 쪼개서 나눈 split-GFP를 이용한다. 일단 나누어진 split-GFP분자들은 형광성을 띄지 않는데, 두 분자가 공간적으로 가까워지면 다시 형광을 띄게 된다. 김 박사는 이 split-GFP 분자 두 개를 포유동물에서 각각 신호를 주는 신경세포(presynaptic)와 신호를 받는 신경세포(postsynaptic)에 표적하여 20nm의 시냅스에서만 다시 녹색형광을 띄게하는 분자 엔지니어링에 성공하였다. 본 기술의 개발로 기존 연구방법의 한계를 극복할 수 있게 되어 이전보다 훨씬 빠르고 정확하게 시냅스를 찾아낼 수 있게 되어 향후 종전의 기술로는 연구가 거의 불가능했던 복잡한 뇌의 신경 네트워크를 이해하고, 나아가 자폐증과 같이 신경망의 이상으로 인한 신경질환의 원인과 치료방법을 연구하는데 큰 역할을 할 것으로 기대된다. 본 연구내용은 편집위원회로부터‘앞으로 가장 많이 인용될 논문들 중 하나’라는 호평을 받으며, 지난 12월 4일 Nature Methods 온라인 판에 게재되었다. mGRASP 기술소개 (mammalian GFP Reconstitution Across Synaptic Partners) 오랜 기간 뇌의 신경망 활동과 행동의 연결고리를 찾고자 하는 신경과학자들의 열망은 최첨단 기술의 개발을 가져왔고, 이를 통해 신경 회로안 시냅스 연결부위를 지도화하는 연구가 계속되어 왔다. 역사적으로 시냅스 형성에 물리적 접촉이 요구된다는 사실에 바탕을 두고, 시냅스 연결성의 존재 여부를 파악하는데 시냅스 전 뉴런의 축삭돌기 축과 시냅스 후 뉴런의 수상돌기 축 사이 겹치는 정도가 이용되었다. 하지만, 이 측정의 척도는 연결가능성을 측정하는 데에만 그쳤다. 왜냐하면 시냅스 후 수상돌기 내에서 축색돌기의 반에 못 미치는 수가 기능적 시냅스 연결도를 형성한다는 결과를 보여주었기 때문이다. 실제적인 시냅스 구조 간 연결 가능성과 통계학적 특성은 고해상도 전자현미경 데이터를 통한 신경회로 복원을 통해 밝혀질 수 있다. 하지만, 최근 최첨단 전자현미경 사용에 있어서의 발달에도 불구하고, 이러한 접근 방식은 신경세포 조직의 중대한 부분을 재 복원하는데 많은 시간이 소모하며, 측정하는 양에도 제한적이다. 이번에 개발된 mGRASP(mammalian GFP Reconstitution Across Synaptic Partners) 기술은 최근 생명공학계에서 널리 쓰이는 녹색형광물질(GFP)을 두 분자로 쪼개서 나눈 split-GFP를 이용한다. 일단 나누어진 split-GFP분자들은 형광성을 띄지 않는데, 두 분자가 공간적으로 가까워지면 다시 형광을 띄게 된다. 김 박사는 이 split-GFP 분자 두 개를 포유동물에서 각각 신호를 주는 신경세포(presynaptic)와 신호를 받는 신경세포(postsynaptic)에 표적하여 20nm의 시냅스에서만 다시 녹색형광을 띄게하는 분자 엔지니어링에 성공하였다. 본 기술의 개발로 기존 연구방법의 한계를 극복할 수 있게 되어 이전보다 훨씬 빠르고 정확하게 시냅스를 찾아낼 수 있게 되어 향후 종전의 기술로는 연구가 거의 불가능했던 복잡한 뇌의 신경 네트워크를 이해하고, 나아가 파킨슨씨병, 자폐증과 같이 신경망의 이상으로 인한 신경질환의 원인과 치료방법을 연구하는데 큰 역할을 할 것으로 기대된다. [붙임 3] 연구 내용 참고자료 (그림1) mGRASP로 시넵스를 광학현미경을 이용하여 발견 mGRASP를 모델동물에 적용. 무형광의 잘려진 GFP 두분자가 시넵스에서 다시 형광형성을 하게됨. 왼쪽은 mGRASP를 이용하여 기억과 학습에 중요한 해마(hippocampus)의 한 신경세포의 시넵스 분포를 디지탈화하여 보여줌. (그림2) 기억과 학습에 중요한 해마(hippocampus)의 신경세포들의 하나하나 3-D위치에 따라 시넵스 분포 관찰을 가능케함. 왼쪽은 신호를 주는 세포의 신경말단투사를 생쥐 뇌의 앞부분부터 뒤부분으로 보여주고 그중의 한 뇌 절편에서 예로 7 신경세포의 시넵스분포를 mGRASP를 이용하여 보여주고 있다. Journal Reference: mGRASP enables mapping mammalian synaptic connectivity with light microscopy Jinhyun Kim, Ting Zhao, Ronald S Petralia, Yang Yu, Hanchuan Peng, Eugene Myers & Jeffrey C Magee Nature Methods (2011) doi:10.1038/nmeth.1784
  • Bio통신원
  • 2011. 12. 08
국내연구진 '뇌 지도 단시간 작성' 신기술 개발...김진현 박사팀 "뇌 신경질환 치료방법 연구에 큰 도움"
  • 헬로디디
  • 2011. 12. 07
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