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Nucleic Acids Res., Jul 03 2026, 54 (13) gkag687 | https://doi.org/10.1093/nar/gkag687 SEM mapping of sequence-specific protein-DNA interactions on long DNA molecules

Chanyoung Noh^1,†, Sangwon Lee^1,†, Yoonjung Kang^1,†, Taesoo Kim¹, Taebin Yun¹, Yoojin Kim¹, Gyuri Park¹, Priyannth R. Sundharbaabu², Sang-Hee Shim³, Kwang-il Lim^4,*, Jung Heon Lee^2,5,*, Kyubong Jo^1,6,*

¹Department of Chemistry, Sogang University, Seoul 04107, Korea
²School of Advanced Materials Science and Engineering, Sungkyunkwan University (SKKU), Suwon 16419, Korea
³Department of Chemistry, Korea University, Seoul 02841, Korea
⁴Department of Chemical and Biological Engineering, Sookmyung Women’s University, Seoul 04312, Korea
⁵Department of MetaBioHealth, Sungkyunkwan University, Suwon 16419, Korea
⁶Center for Nano Materials, Sogang University, Seoul 04107, Korea

^∗To whom correspondence should be addressed.: Kyubong Jo
Correspondence may also be addressed to Jung Heon Lee.
Correspondence may also be addressed to Kwang-il Lim.
^†The first three authors should be regarded as Joint First Authors.

Abstract

Direct visualization of protein-binding positions along individual DNA molecules provides direct readouts of binding location, occupancy, and heterogeneity beyond the reach of ensemble assays. However, existing single-molecule imaging methods face a persistent trade-off between spatial resolution, field of view, and throughput. Here, we establish an scanning electron microscopy (SEM)-based approach that combines contrast enhancement with sequence-defined labeling to image extended DNA molecules and resolve protein-bound regions along their contour. We validate this capability across distinct binding regimes, including sequence-defined streptavidin-fluorescent protein labels on biotinylated λ DNA, mapping of densely bound dCas9 regions on plasmid DNA, and machine-learning-assisted detection of localized dCas9 binding on human genomic DNA (F1 = 0.97). SEM achieves mean positional offsets of 410 ± 325 bp for nick-translated labels and 116 ± 63 bp for dCas9-bound regions, ~3-fold improved over fluorescence imaging, while supporting large-area surveys of extended DNA molecules across multi-scale magnifications-a capability not accessible by transmission electron microscopy or atomic force microscopy. These results establish SEM as a scalable platform for simultaneous structural visualization and quantitative mapping of sequence-specific DNA-protein interactions along individual DNA molecules.

논문소개전체 설명

DNA는 유전정보를 저장할 뿐 아니라 다양한 단백질과 결합하여 유전자 발현, 복제 및 DNA 복구와 같은 생명현상을 조절한다. 이러한 DNA-단백질 상호작용을 이해하기 위해서는 긴 DNA 분자 위에서 특정 단백질이 어디에 결합하는지를 직접 관찰할 수 있는 기술이 필요하다.

지금까지는 형광현미경, 초고해상도 형광현미경(super-resolution microscopy), 원자힘현미경(AFM), 투과전자현미경(TEM) 등이 이용되어 왔다. 형광현미경은 해상도가 제한적이며, 초고해상도 형광현미경은 해상도를 크게 향상시켰지만 일반적으로 촬영 속도가 느리고 긴 DNA를 높은 처리량으로 분석하는 데 한계가 있다. AFM은 높은 해상도를 제공하지만 관찰 속도가 느리고 분석 가능한 영역이 좁으며, TEM은 높은 공간 분해능을 제공하지만 지지막에서 발생하는 배경 신호의 영향을 받아 이미지 대비가 낮아질 수 있고 넓은 영역의 긴 DNA를 효율적으로 분석하기 어렵다.

본 연구에서는 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 긴 DNA 분자 위의 단백질 결합 위치를 단일분자 수준에서 분석하는 새로운 플랫폼을 개발하였다. SEM은 형광현미경과 유사한 방식으로 시료를 간편하게 준비할 수 있어 복잡한 시편 제작 과정이 필요하지 않으며, 깨끗한 배경에서 긴 DNA를 높은 대비로 영상화할 수 있다. 또한 넓은 영역을 자동으로 촬영할 수 있어 수십에서 수백 kb 길이의 DNA를 높은 처리량으로 분석할 수 있다. 이를 이용하여 특정 염기서열을 인식하는 단백질의 결합 위치를 정확하게 지도화하고, 기존 광학현미경으로는 구별하기 어려운 인접한 결합 위치까지 성공적으로 분석하였다.

본 연구는 SEM이 형광현미경의 높은 처리량과 TEM 및 AFM의 나노미터 수준 공간 분해능을 동시에 구현할 수 있는 새로운 단일분자 분석 플랫폼임을 제시하였다. 이러한 접근법은 DNA-단백질 상호작용 연구뿐 아니라 크로마틴 구조 분석, 후성유전체 연구 및 차세대 장거리 유전체 분석 기술 개발에도 폭넓게 활용될 것으로 기대된다.

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