카바페넴 내성 장내세균속균(Carbapenem-resistant Enterobacterales, CRE) 중에서도 카바페넴 분해효소를 생성하여 강한 유전적 전파력을 보이는 CPE(Carbapenemase-producing Enterobacterales)는 의료기관 내 집단 감염의 주요 원인으로 작용한다. 특히 CPE는 마지막 치료제인 카바페넴계 항생제에 대한 내성을 나타내며 전 세계적으로 빠르게 확산되고 있는 주요 공중보건 위협으로, 감염 확산 차단을 위해서는 신속하고 정확한 진단이 필수적이다. 그러나 기존의 표준 진단법인 qPCR은 높은 정확도를 제공하는 반면 고가의 장비와 숙련된 인력을 필요로 하여 장기요양병원이나 자원 제한 환경에서의 적용에는 한계가 있다.

이에 본 연구에서는 주요 CPE 내성 유전자인 blaKPC 및 blaNDM을 신속하고 민감하게 검출하기 위해 등온 증폭 기술인 recombinase polymerase amplification(RPA)과 CRISPR/Cas12a를 하나의 반응관에서 동시에 수행하는 one-pot RPA–CRISPR/Cas12a 시스템(RCCS)을 개발하였다. 특히 기존 CRISPR 진단에서 널리 사용되는 정형 PAM 대신, 비정형(suboptimal) PAM을 적용한 crRNA를 설계·선별함으로써 one-pot 반응 환경에서 증폭과 Cas12a 절단 반응 간의 동역학적 균형을 최적화하였다. 그 결과, two-step 방식에서는 우수한 성능을 보이던 정형 PAM과 달리, one-pot 조건에서는 특정 suboptimal PAM이 더 높은 민감도를 나타내는 것을 확인하였으며, 이는 CRISPR 기반 진단에서 PAM 선택이 반응 환경에 따라 달라질 수 있음을 보여주는 중요한 결과이다.

최적화된 조건에서 개발된 RCCS 시스템은 blaKPC에 대해 10⁻¹⁷ M, blaNDM에 대해 10⁻¹⁶ M 수준의 높은 민감도를 확보하였으며, 약 40분 이내에 검출이 가능한 신속성을 확인하였습니다. 또한 반응 조건 최적화를 통해 one-pot 시스템에서의 안정적인 신호 생성과 재현성을 확보하였고, 나아가 본 연구에서는 이러한 진단 시스템을 실제 현장에서 활용할 수 있도록 휴대형 형광 기반 검출 장치를 함께 개발하여, 반응 온도 유지와 실시간 신호 측정을 통합한 현장진단(point-of-care testing, POCT) 플랫폼으로 확장하였습니다.

임상 적용 가능성을 평가하기 위해 직장도말 검체 44건을 대상으로 검증을 수행한 결과, 본 시스템은 qPCR 결과와 완전히 일치하는 100%의 민감도와 특이도를 나타냈으며, 모든 검체에서 정확하게 표적 유전자만을 검출 하는 것을 확인하였습니다. 다만 형광 신호와 Ct 값 간 상관성이 낮아 정량 분석보다는 정성 선별검사에 적합함을 확인하였고, 이러한 결과는 본 시스템이 임상 현장에서 신속한 스크리닝 도구로 활용될 수 있음을 시사하고 있습니다.

본 연구의 의의는 CRISPR 기반 one-pot 진단에서 핵심적인 기술적 한계로 지적되어 온 반응 간섭 문제를 suboptimal PAM 설계를 통해 해결하고, 이를 실제 임상검체와 휴대형 장치에 적용 가능한 수준으로 구현했다는 점에 있습니다. 또한 단순한 열처리 기반 전처리만으로 검체 분석이 가능하여, 복잡한 실험 장비 없이도 신속한 진단이 가능하다는 점에서 현장 적용성이 매우 높은 것으로 사료됩니다. 향후 시약의 동결건조화 및 다중 내성 유전자 동시 검출로의 확장이 이루어진다면, 본 기술은 다양한 의료 환경에서 항생제 내성 감시 및 감염 관리에 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 기대됩니다.

• 형식Research article
• 게재일2026년 04월 (BRIC 등록일 2026-04-29)
• 연구진국내 연구진
• 분야 바이오·의료융합 > 바이오센싱 및 나노바이오물질