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충남대학교

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Biosens. Bioelectron., Available online 11 February 2026 | https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118514 Nucleic acid detection via protein readout through Cas-controlled gating of cell-free protein synthesis

Yu Jin Park ¹,Dong-Yeon Song ¹,Hye Bin Jeon ¹, Dong-Myung Kim ^1,*

¹Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, Chungnam National University, 99 Daehak-ro, Yuseong-gu, Daejeon, 34147, South Korea

^*Corresponding author: correspondence to Dong-Myung Kim

Abstract

We present a modular platform that converts CRISPR target recognition into programmable protein outputs for nucleic acid detection. This system couples Cas-mediated collateral cleavage with cell-free protein synthesis. In the presence of a target, Cas-mediated collateral cleavage releases an extension-competent trigger DNA that gates reporter expression. Although collateral cleavage is inherently indiscriminate, we achieve deterministic fragment generation by employing chemically programmed precursors bearing backbone modifications-exemplified here by phosphorothioate linkages-that constrain cleavage to predefined sites. Using Bacillus anthracis and E. coli O157:H7 as a model, the developed CRIVER assay enables concurrent readouts of 16S rRNA together with the species-specific capB or ecf1 loci by integrating Cas13a-mediated RNA recognition and Cas12a-mediated DNA recognition into a dual-channel workflow. Taken together, proposed method establishes addressable signaling at the protein layer, supports protein-based outputs in a modular workflow, and provides a general route to sensitive, dual-channel nucleic acid detection.

논문소개전체 설명

CRISPR 표적 인식을 단백질 출력으로 전환하는 새로운 핵산 검출 플랫폼, CRIVER
병원체의 신속하고 정확한 검출은 감염병 대응, 식품 안전, 생물방어 분야에서 핵심적인 과제이다. 기존의 PCR이나 등온 증폭법은 높은 민감도를 제공하지만, 전문 장비와 복잡한 다단계 과정이 요구되는 한계를 가지고 있다. 이에 본 연구팀은 CRISPR-Cas 시스템의 표적 인식 능력을 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis)과 결합하여, 핵산 검출 결과를 프로그래밍 가능한 단백질 신호로 전환하는 새로운 플랫폼인 CRIVER(Cas-regulated in vitro expression of reporters)를 개발하였다.
CRIVER의 핵심 원리는 Cas 뉴클레아제의 부수적 절단(collateral cleavage) 활성을 활용하되, 이를 부위 선택적 절단으로 전환하여 무세포 단백질 합성을 유도할 수 있는 DNA 트리거를 생성하는 데 있다. 생성된 DNA 트리거는 불완전한 발현 카세트에 결합하여 프라이머 신장을 통해 전사 주형을 완성하고, 리포터 단백질의 합성을 유도한다. CRIVER는 RNA와 DNA 표적을 동시에 검출하는 이중 채널 분석이 가능하다. Cas13a 채널에서는 표적 RNA 인식 시 활성화된 Cas 뉴클레아제가 전구체의 RNA 구간을 제거하여 DNA 트리거를 방출하고, Cas12a 채널에서는 포스포로티오에이트로 보호된 전구체 내 포스포다이에스터 구간만 선택적으로 절단하여 트리거를 생성한다. 본 연구에서는 탄저균(Bacillus anthracis)과 장출혈성 대장균(E. coli O157:H7)을 모델로 삼아, 속(genus) 수준의 16S rRNA 검출과 종(species) 특이적 유전자(capB, ecf1) 검출을 하나의 워크플로우 내에서 동시에 수행하는 Dual-CRIVER 시스템을 구현하였다.
민감도 측면에서 NanoLuc 루시퍼라제를 리포터로 사용했을 때, Cas13a 기반 RNA 검출은 10 fM, Cas12a 기반 DNA 검출은 100 fM 수준의 검출 한계를 달성하였다. 또한 Dual-CRIVER를 실제 세균 용해물에 적용한 결과, 속 수준의 확인과 병원성 종의 식별을 동시에 수행할 수 있음을 검증하였다.
CRIVER는 출력이 단백질 기반이므로, 형광·발광·효소·비색 등 다양한 리포터와 유연하게 연결할 수 있어 검출 환경과 장비 조건에 맞춘 맞춤형 진단 설계가 가능하다. 이러한 모듈형 구조와 이중 채널 분석 능력은 임상, 환경, 식품 안전, 생물방어 등 폭넓은 분야에서의 활용 가능성을 제시한다.

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