1. 논문관련 분야의 소개, 동향, 전망을 설명, 연구과정에서 생긴 에피소드

1a. 논문 관련 분야 소개
 - 단백질 항상성과 유비퀴틴-프로테아솜 시스템
정상 세포에서는 단백질의 합성, 접힘과 이동, 그리고 분해가 서로 조화롭게 균형을 이루고 있습니다. 이러한 균형을 단백질 항상성 (Proteostasis)이라고 하며, 단백질 항상성이 깨지게 되면 세포는 정상적으로 기능하지 못하고 암, 노화, 신경퇴행성 질환으로 이어지게 됩니다 (William et al., Science 2008). 진핵 세포는 단백질 항상성을 유지하기 위해 표적 단백질에 유비퀴틴 (Ubiquitin) 이라는 작은 단백질 포스트잇을 붙여서 이를 프로테아좀이라는 분해 효소로 제거하는 시스템 (Ubiquitin-Proteasome system)을 갖고 있습니다 (그림1). 유비퀴틴-프로테아솜 시스템에서 가장 중요한 단계는 유비퀴틴 연결효소 (Ubiquitin ligase)가 표적 단백질은 인식하여 유비퀴틴 (Ubiquitin)을 부착하는 단계입니다. 최근 연구에서 사람에게는 710 개의 유비퀴틴 연결효소가 있으며, 가능한 표적 단백질과의 상호작용은 11,159,034 가지 경우가 있다고 보고되고 있습니다 (Shu et al., CSBJ 2023). 그러나 알려진 예측에 비해 지금까지 밝혀진 유비퀴틴 연결효소의 유비퀴틴 부착 메카니즘은 극히 일부에 불과하며, 특히 분해해야 할 단백질을 유비퀴틴 연결효소가 어떻게 선별적으로 인식하고 어떤 효소 활성을 통해 유비퀴틴을 부착하는지에 대해서는 계속 꾸준히 연구되고 있습니다. 이번 연구에서는 유비퀴틴 연결효소 TRIM72 단백질의 구조를 규명하고 유비퀴틴 연결 활성이 어떻게 조절되는지에 대한 메커니즘 연구를 수행하였습니다.

                                 그림1. 유비퀴틴이 부착된 단백질은 프로테아좀에 의해 분해됩니다. 

                                      (https://www.facebook.com/cellularscribbles/)

 - 세포막 수리 시스템
진핵 세포는 세포막에 의해 외부의 환경과 분리되어 있습니다. 세포막은 얇은 지질 이중층으로 구성되어 있으며 세포의 가장 경계면에서 외부의 위험으로부터 세포 자신을 보호함과 동시에 세포내 항상성 유지를 위한 이온 및 대사 물질의 이동을 조절하는 플랫폼 역할을 합니다. 다양한 물리적, 화학적 스트레스로 인해 세포막에 손상이 오면, 손상 부위로부터 세포질은 빠르게 빠져나오고 세포는 더 이상 형태를 유지하지 못하고 사멸합니다. 다행스럽게도, 세포는 자신의 세포막을 수리하는 시스템을 갖고 있습니다. 이를 세포막 수리 시스템 (Membrane repair system)이라고 하며, 짧게는 몇 초, 길게는 몇 분 안에 손상된 세포막을 자가 수리하여 세포질을 보호하고 생존할 수 있습니다 (그림2). 매우 흥미로운 현상임에도 불구하고 이에 대한 분자생물학적 기전은 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 지금까지의 연구 결과들을 종합해보면 세포막의 손상 정도에 따라 각각 독립적인 세포막 수리 시스템들이 작동하는 것으로 보이며, 리소좀 (Lysosome)이라는 작은 단백질 분해효소 주머니를 포함한 소포체들이 손상 위치에 빠르게 모여 패치를 이루어 수리에 필요한 지질막을 보충한다는 것, 그리고 이 과정은 칼슘과 ATP 농도에 의존적이며 세포 소기관의 지질막을 리모델링하는 ESCRT pathway가 중요하게 관여한다는 것 등이 알려져 있습니다 (Dias & Nylandsted, Cell Discovery 2021). 한편, 근육 세포에서는 TRIM72 단백질이 작은 소포체들을 손상부위로 전달한다고 보고되었는데 (Cai et al., Nat Cell Biol. 2009), 이번 연구에서는 지질막에 결합된 TRIM72 복합체의 구조를 극저온 토모그래피 기법으로 규명하고 TRIM72의 유비퀴틴 전달이 어떻게 지질막 위에서 복합체를 이루었을 때 활성화되는지 연구하였습니다 (Park et al., Nat Struct Mol Biol. 2023).

그림2. 성게알 모델에서 칼슘의존적 세포막 수리 과정. 칼슘이 있을 때 (그림2a), 미세침으로 세포막을 찔렀을 때 세포막이 복구되는데 반해 칼슘이 없을 때에는 (그림2b) 세포막을 복구하지 못하고 세포질이 터져 나오는 것을 볼 수 있습니다. (McNeil & Kirchhausen, Nat Rev Mol Cell Biol. 2005)

1b. 논문 관련 분야 동향 및 전망
 - 구조생물학이란?
구조생물학 (Structural biology)이란 생명 현상을 분자 구조 단위로부터 이해하려는 연구 분야입니다. 구조적 다양성에 의해 다양한 기능을 갖는 단백질들이 어떻게 이들의 활성과 상호작용으로 세포의 생명활동에 기여하는지를 중심적으로 연구합니다. 지난 60여년간의 구조생물학의 역사에 비추어 볼 때, 최근 수년 동안 구조생물학 분야는 엄청난 발전을 이루었습니다. 극저온 전자현미경 (CryoEM)의 발전과 알파폴드 (Alphafold)를 이용한 구조 예측으로 기존 X-선 결정학으로 해결할 수 없었던 어려운 단백질 복합체 구조를 예측하고 결정화가 어려운 막단백질의 구조를 고해상도로 규명할 수 있게 되었습니다. 이외에도 X선 자유 에너지 레이저 (XFEL)의 개발로 분자 단위의 효소 활성을 펨토초 시간 단위로 관찰할 수 있게 되었습니다.

 이번 연구에서는 단백질 X-선 결정학 (X-ray Crystallography), 극저온 전자현미경을 이용한 토모그래피 (CryoET)와 서브 토모그램 평균화 (Subtomogram averaging, 그림3), 소각 엑스선 산란 (SAXS), 가교결합 질량분석 (Cross-linking Mass spectrometry), 알파폴드 구조 예측 등의 다양한 구조생물학적 기법이 사용되었습니다. 이외에도 생화학, 분자생물학, 생물정보학, 세포생물학 등의 다른 분야의 기법들 역시 사용되었으며 이러한 협업을 통해 생명 현상을 이해하려는 연구가 현재 활발히 진행되고 있습니다.

                       그림3. Dynamo 프로그램을 이용한 리포솜 상에 결합한 TRIM72의 서브 토모그램의 추출.

 - 표적 단백질 분해 기법과 유비퀴틴 연결효소
유비퀴틴 연결효소에 대한 연구는 표적 단백질 분해 기법 (Targeted proteolysis)의 발전과 더불어 현재 전성기를 달리고 있습니다. 2000년대 초반, 유비퀴틴 연결효소와 분해할 표적 단백질이 서로 결합할 수 있도록 도와주는 화합물 (PROTAC)을 사용하면 원하는 단백질을 제거할 수 있다는 개념이 처음으로 제시되었습니다 (Sakamoto et al., PNAS 2001, 그림4). 이 방법의 가장 큰 장점은 기존의 활성 부위 억제제로 저해할 수 없는 타겟 단백질을 원천적으로 제거하여 효과적으로 타겟의 활성을 차단할 수 있다는 것입니다. 현재 많은 제약회사들의 PROTAC 제제들이 임상 시험 중에 있으며 앞으로도 더욱 활발히 연구될 것으로 기대됩니다.

                                         그림 4. PROTAC 기반의 타겟 단백질 제거 약물의 작동 메커니즘.(https://blogs.bcm.edu/2020/09/03/from-the-labs-novel-protac-has-a-two-front-improvement/)

 이와 더불어 근래에 등장한 분자접착제 (Molecular glue)의 개념은 이미 알려진 유비퀴틴 연결효소와 기질 단백질 간의 결합을 강화시키는 방향으로 연구되고 있습니다. 이 방법은 세포 내 단백질 결합을 그대로 이용하기 때문에 부작용이 적을 것으로 예상되며, 분자접착제의 크기와 구조가 Rule of five (RO5)를 만족하기 때문에 생체 내 약물 전달에 유리하다는 장점이 있습니다. 이론적으로 모든 저분자 화합물들은 분자 접착제의 후보군이기 때문에, 더욱 많은 잠재력을 갖고 있습니다.

 마지막으로 최근 유비퀴틴 연결효소가 거대 복합체 (E3-E3 super-assembly)를 이루어 서로 유기적으로 작동하여 표적 단백질에 유비퀴틴을 부착할 수 있다는 흥미로운 연구 결과가 보고되었습니다 (Horn-Ghetko et al., Nature 2021). 이와 함께 거대 유비퀴틴 연결효소 복합체의 구조와 기질 인식에 대한 연구들이 최근 앞다투어 보고되고 있습니다 (Hunkeler et al., Ehrmann et al., Dietz et al., Science 2023). 이번 저희 연구에서도 TRIM72 단백질이 지질막에 결합하여 고차 복합체를 형성하여 유비퀴틴을 전달할 수 있음을 보고하였습니다. 이러한 거대 유비퀴틴 연결효소 복합체의 기능과 상호작용에 대한 연구가 구조생물학의 발전과 더불어 활발히 진행될 것으로 예상합니다.

1c. 연구과정에서 생긴 에피소드
이 연구는 제가 고려대학교 구조생물학 실험실에 들어오기 전인 2008년부터 시작되었습니다. 당시 고려대학교 고영규 교수님 실험실에서 새로운 근육분화를 억제하는 TRIM72 유전자를 발견하여 저희 실험실에서 구조와 활성에 대한 연구를 수행하고 있었습니다. 2011년에 제가 석사과정으로 입학했을 때 운이 좋게도 TRIM72 단백질 결정이 이미 실험실에 있었습니다. 비록 8 A의 저해상도로 회절하였지만, 결정이 만들어진다는 사실 자체는 매우 고무적이었고 이후 실험을 지속하는 데 있어 큰 버팀목이 되었습니다. 보다 튼튼한 결정을 만들기 위한 노력의 결과로 2014년에 드디어 2.7 A로 회절하는 TRIM72 단백질의 결정을 얻어 겨우 구조를 규명할 수 있었습니다. 이후 결정 구조 분석을 끝내었을 때, 그 기능을 유추함에 있어 막에 결합될 것으로 예상되었고 또한 유비퀴틴 연결 효소로 알려져 있었기에 이에 대한 실험들을 몇 년여간 수행하였습니다. 그 당시에는 이 프로젝트가 끝나기까지 10년이 더 걸릴 것이라고는 상상도 하지 못하였습니다. 몇년여간의 연구 결과, 놀랍게도 이 단백질은 용액 상에서는 유비퀴틴 연결 활성이 없었습니다. 실험을 하는 동안에는 이미 가설 설립 과정에서부터 활성이 없다는 것은 전혀 상정하지 않았기에, 다양한 조건과 모델 시스템을 통해 유비퀴틴 활성을 관찰하려고 노력하였고 이에 많은 시간과 노력을 소모하였지만, 반복적으로 재현되는 유비퀴틴 연결 활성은 전혀 관찰할 수 없었습니다. 다행히도 문헌 조사를 바탕으로 기존에 활성이 있는 것으로 알려진 유비퀴틴 제한효소와 구조 및 서열을 비교하여 point mutation들을 도입한 결과, 린치핀으로 알려진 위치의 글루타민을 아르기닌으로 치환하였을때에야 비로소 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었습니다. 이러한 결과를 통해 지질막에 결합하였을 때에만 유비퀴틴 연결효소의 활성이 증가하는 것을 관찰하여 실험결과를 겨우 논문으로 정리할 수 있었습니다. 이후 2021년 논문을 투고한 이후에도 2년여동안 극저온 토모그래피 실험과 추가적인 유비퀴틴 활성 실험 등을 수행하였고, 결과적으로 10여년이 넘는 시간이 지난 후에야 비로소 연구 결과가 세상 밖으로 나올 수 있었습니다. 모든 순간이 지난 지금에 와서는 그저 중간에 멈추지 않고 연구를 계속할 수 있었기에 논문으로 출간되어 빛을 볼 수 있었다는 생각에 그저 감사한 마음뿐입니다.

2. 연구를 진행했던 소속기관 또는 연구소에 대해 소개 부탁드립니다.

제가 작년까지 몸담았던 고려대학교 생명과학과 송현규 교수님 실험실 (https://song.korea.ac.kr/)은 세포내 단백질 분해 과정에 대해 오랫동안 연구하였습니다 (그림5). 특히 세포내 단백질의 N-말단이 노출된 이후 (Chen et al., PNAS 2021), N-말단 잔기 변형을 거쳐 (Kim et al., PNAS 2022, Kim et al., PNAS 2016) 어떻게 유비퀴틴 연결 효소에 인식되어 분해되는지 (Choi et al., Nat Struct Mol Biol. 2010, Shin et al., BBRC 2021)에 대해 중점적으로 연구하였습니다. 이외에도 자식작용 (Autophagy) 과정에서 유비퀴틴 유사 단백질이 어떻게 지질막에 부착되어 활성화되는지 (Hong et al., Nat Struct Mol Biol. 2011, Hong et al., Acta D. 2012, Kim et al., Autophagy 2015, Kim et al., Autophagy 2018, Kwon et al., Nat Commun. 2018), 외부 병원체의 침입 과정에서 유비퀴틴 및 유비퀴틴 유사 단백질을 이용하는 병원성 효소와 숙주 세포의 자식작용 수용체가 어떻게 작동하는지 (Kim et al., Nat Commun. 2013 Kwon et al., Autophagy 2016, Kwon et al., BBRC 2017, Kim et al., J Mol Bio. 2018)에 대해서도 연구한 바 있습니다. 또한 원핵 세포의 프로테아좀 유사 단백질의 기능과 조절 (Lee et al., Nat Struct Mol Biol. 2010, Lee et al., Mol Cells 2011, Sung et al., J Biol Chem. 2013, Sung & Song Plos One 2014, Kim et al., EMBO J. 2022)에 대해서도 활발히 연구하고 있습니다.

                                그림5. 고려대학교 교정에서 찍은 송현규 교수님 실험실 단체 사진 (2021년)

저는 위 연구실에서 박사 학위 및 박사후 과정을 마치고 2022 년 스위스 바젤에 위치한 프리드리히 미셔 생의학 연구소 (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research; FMI)의 Nicolas Thoma 박사님의 연구실 (https://www.thomalab.org/)에 박사후 연구원으로 합류하였습니다 (그림6). 이곳에서는 탈리도마이드와 유도체들이 어떻게 셀레브론 단백질에 결합하여 단백질 분해를 유도하는지 (Fischer et al., Nature 2014, Petzold et al., Nature 2016, Sievers et al., Science 2018), 그리고 CDK 억제제가 어떻게 분자접착제로서 CyclinK를 제거할 수 있는지를 (Słabicki et al., Nature 2020) 밝힌 바 있습니다. 이외에도 유비퀴틴 연결효소 복합체의 구조, 기능 및 조절 (Lingaraju et al., Nature 2014, Tsai et al., Mol Cell 2023)에 대해 연구하고 있습니다. 단백질 분해 과정 외에도 전사 인자 조절에 대한 연구도 활발히 하고 있으며, 특히 뉴클레오좀 상에서 DNA 데미지가 어떻게 인식되는지 (Matsumoto et al., Nature 2019), 뉴클레오좀에 의해 DNA 센서 효소의 활성이 어떻게 직접적으로 조절되는지 (Pathare et al., Nature 2020), 그리고 다양한 전사 인자가 뉴클레오좀 DNA를 어떻게 인식하고 상호 작용하는지 (Michael et al., Science 2019; Michael & Thoma, Cell 2021, Michael et al., Nature 2023)에 대해 연구한 바 있습니다.

                                          그림6. 이탈리아 북부의 마지오레 호수를 바라보는 Thoma lab (2023년).

3. 연구 활동 하시면서 평소 느끼신 점 또는 자부심, 보람

연구 결과를 얻는 과정은 많은 시간과 노력을 필요로 합니다. 어떤 실험들은 결과를 얻고 데이터를 분석하기까지 몇 달이 넘는 시간이 걸리기도 합니다. 심지어 그렇게 얻은 결과가 설계나 실험적인 오류, 또는 실수로 인해 그저 실패로 끝날 수도 있습니다. 안타깝게도 제 경우 대부분의 실험은 실패하였으며 오직 소수의 실험에서만 만족스러운 결과를 얻을 수 있었습니다. 하지만 이 고통스러운 과정을 견디지 못한다면 어떤 새로운 과학적 발견도 할 수 없을 것입니다. 헤모글로빈의 구조를 밝힌 막스 페루츠 (Max Perutz)도 이와 같은 연구 과정의 어려움을 토로한 바 있습니다. (막스 페루츠 저, 과학에 크게 취해. 대한민국, 솔, 2004). 그것은 홀로 소설을 쓰는 작가처럼, 아무도 신경 쓰지 않는 집안일을 묵묵히 해내는 이처럼, 많은 인내가 필요합니다. 하지만 그 끝에서 결과물을 보았을 때의 기쁨은 분명히 그간의 시간과 노력을 모두 보상하고도 남을 것입니다.

4. 이 분야로 진학하려는 후배들 또는 유학준비생들에게 도움이 되는 말씀을 해 주신다면?

최근 연구실의 지원으로 Susan Lindquist School on Proteostasis에 참가하여 좋은 연구자들을 만나서 많은 공부를 할 수 있었습니다. 특히 MRC-LMB의 Ramanujan Hegde 박사님으로부터 중요한 조언을 들을 수 있었습니다. 그 중 가장 기억에 남는 것은 바로 연구자로서 명확하고 구체화된 하나의 질문을 갖고 그것에 대해 탐구하는 것이 필요하다는 것이었습니다. 이와 함께 의미 있는 질문을 던질 수 있도록 조언을 줄 수 있는 좋은 멘토를 만나는 것도 무척이나 중요하다고 생각합니다.

5. 연구 활동과 관련된 앞으로의 계획이 있으시다면?

현재 저는 RNA polymerase II의 mRNA 전사 개시를 조절하는 매개복합체 (Mediator complex)에 대한 연구를 수행하고 있습니다 (그림7). 매개복합체는 30개의 단백질로 이루어진 단백질 복합체로서 어떻게 이들이 전사 인자들과 결합하여 유전자 특이 전사를 유도하는지를 중심으로 연구하고 있습니다. 2024년에는 실험실이 로잔 연방 공과대학교 (Ecole polytechnique federale de Lausanne; EPFL)로 이전할 계획에 있으며, 단백질 분해 및 DNA 전사 과정 조절에 대한 연구를 지속할 예정입니다. 향후에는 세포내 단백질 항상성 유지와 관련된 현상들을 극저온 토모그래피를 비롯한 다양한 구조생물학적 기법들을 이용하여 탐구해보고 싶습니다.

그림 7. 매개 복합체 (Mediator complex)의 작동 예상 모델.매개 복합체가 일반 전사 인자, RNA PolII, 그리고 enhancer 영역의 유전자 특이 전사 인자와 결합하여 전사를 조절할 것으로 예상하고 있습니다. (https://www.activemotif.com/blog-50-years-eukaryotic-transcription/)

6. 다른 하시고 싶은 이야기들.....

연구 결과를 저널에 게재하기까지 셀 수 없이 많은 도움을 받았습니다. 포항 가속기 연구소의 김연길 박사님, 박석열 박사님, 진경식 박사님, 오사카 대학의 Yamashita Eiki 박사님, 그리고 스텝 분들께 감사드립니다. 밤새며 실험하는 동안 많은 것들을 배울 수 있었습니다. KBSI의 남명희 박사님, 정형섭 박사님께서도 많은 실험적인 도움과 조언을 주셨습니다. GIST의 박지용 교수님과 장세환 박사를 비롯한 박지용 교수님 실험실 구성원들로부터 질량 분석 실험과 결과 분석에 많은 도움을 받았습니다. KIST 이경은 박사님께도 초기 전자현미경 실험과 분석에 많은 도움을 받았습니다.. 지금은 성균관 대학교로 옮기신 현재경 교수님으로부터 토모그래피 데이터 분석을 배울 수 있었던 것은 행운이었습니다. 이 지면을 빌어 감사드립니다. 그리고 논문이 나오기까지 많은 노력을 아끼지 않으신 송현규 선생님과 병천형과 병길형, 봉헌, 우석, 주현을 비롯한 실험실 동료들, 마찬가지로 포닥과 육아를 병행하고 있을 지윤, 지욱, 그리고 많은 응원과 조언을 준 김태성 교수님 실험실의 송주한, 김면수 박사님, 논문을 정리할 수 있도록 많은 도움을 준 Nico와 Thoma lab 친구들, 항상 함께 해주어 고마운 고려대학교 문학회 선배님들과 민기, 선호, 시홍, 부모님께도 감사의 인사를 전합니다. 마지막으로 모든 것을 내려 두고 이곳까지 함께 와준 아내와 딸 주은이에 사랑한다고 말하고 싶습니다.