1. 논문관련 분야의 소개, 동향, 전망을 설명, 연구과정에서 생긴 에피소드

우리 몸이 감염원의 침입에 대응하는 면역을 활성화 시키기 위해서는 가장 먼저 침입을 인지해야 합니다. 톨 유사 수용체 3 (Toll-like receptor 3; TLR3) virus genome이나 replication 과정의 중간체로 생성되는 dsRNA을 인식하여 이합체를 형성 및 활성화 되며, 바이러스의 감염을 인식하고 Type I interferon 분비를 유도하여 바이러스에 대응하도록 합니다.

기존의 밝혀진TLR3-dsRNA complex구조에서 TLR3는 40-50 base pair의 RNA를 인식해 활성화 되는 것을 밝혔습니다. 하지만 강력한 면역반응을 위해서는 이보다 훨씬 긴 RNA가 필요하며 길이가 길수록 더 강한 반응을 유도한다는 보고가 있습니다. 본 논문TLR3가 긴 dsRNA 사슬에 결합할 때, 어떠한 형태로 complex를 이루는지 극저온 전자현미경 (Cryo-EM)으로 복합체의 구조를 관찰하고 TLR3 활성화에서 dsRNA길이가 어떤 영향을 주는지 구조적으로 밝힌 연구 입니다.

Cryo-EM을 통해 TLR3가 긴 dsRNA 사슬에 결합한 형태를 관찰했을 때, 기존에 알려진 것과 다르게 TLR3가 dsRNA 사슬을 따라 클러스터를 형성하고 있었습니다. 특히 전자현미경 시료에 사용된 TLR3는 막에 고정되어 있지 않음에도, dsRNA사슬에서 의 일정한 간격 및 일정한 방향으로 규칙적인 클러스터가 형성되는 것을 확인하였습니다. 실제 세포 내에서TLR3-dependent signaling에서 TLR3 클러스터의 중요성을 입증하고자 리간드인 dsRNA와 비경쟁적인 TLR3 중화항체의 작용기전을 확인하였습니다. 그 결과 비경쟁적인 TLR3 중화항체는 입체장애를 통해 TLR3 클러스터 형성을 방해함을 통해 TLR3신호를 저해하는 것을 밝혀 세포 내에서 TLR3활성에는 클러스터 형성이 중요하다는 것을 증명하였습니다.

TLR3는 바이러스 면역에 중요한 역할을 합니다. 실제로TLR3 혹은 그 하류 신호 단백질이 제 기능을 못하는 경우 코로나나 인플루엔자 감염증상이 중증으로 가는 위험이 높아진다는 보고가 있습니다. 이번 논문은 바이러스 면역에서 중요한 역할을 하는TLR3신호의 완전한 활성에 대한 모델을 제시하여 TLR3를 타켓하는 치료제 개발에 도움이 될 거라 예상됩니다. 특히 백신개발에서 면역반응을 높이기 위해 면역증강제를 같이 사용하는데 면역증강제 디자인 및 백신플랫폼 디자인에 도움이 될 것이라 생각됩니다.

2. 연구를 진행했던 소속기관 또는 연구소에 대해 소개 부탁드립니다.

저는 현재 포항공대 생명과학과 이지오 교수님(항체구조생물학 연구실) 지도하에 박사과정을 진행하고 있습니다. 저희 연구실은 X-ray crystallography와 Cryo-EM single-particle analysis을 통해 단백질 구조를 규명하는 연구를 하고 있습니다. 특히 면역과 관련된 단백질 구조에 관심이 많으며 면역수용체의 구조를 통해 분자수준에서의 면역수용체의 리간드 인식 및 활성화 원리, 면역수용체 신호복합체의 구조 및 신호전달 기작 등에 대한 연구를 주로 수행하고 있습니다.

저희 연구실은 최근에 포항시 세포막단백질연구소로 이전하였습니다. 세포막단백질 연구소에는 구조분석에 핵심적인 Cryo-EM 장비를 다수 보유해 Cryo-EM single-particle analysis 시료 스크리닝 및 데이터 수집 모두 할 수 있습니다. Cryo-EM 장비뿐만 아니라 Cryo-EM 자동 시편 준비 장비 (chameleon), 구조분석을 위한 computer resource (GPU, CPU, storage server) 등을 갖추고 있습니다. 연구소가 위치한 포항시에는 방사선 가속기가 있어 단백질 구조분석을 하는데 최적화되어 있는 연구소 입니다. 최근에 코로나로 인한 팬데믹으로 백신과 치료용 항체 개발에 대한 사회적인 중요성이 대두되면서 단백질 구조를 활용한 백신기술 및 플랫폼 개발, 치료용 항체 개발에 대한 연구도 같이 진행되고 있습니다.

이지오 교수님 연구실 (https://jieoh1.wixsite.com/jieoh)
세포막 단백질 연구소 (https://imp.or.kr )

3. 연구 활동 하시면서 평소 느끼신 점 또는 자부심, 보람

극저온 전자현미경을 통한 단백질 구조규명은 힘들고 복잡한 과정이지만 한편으로는 매력적인 일 입니다. 단백질에 대한 현상을 간접적으로 관측하거나 측정하는 것이 아닌 현미경을 통해 다양한 조건에서 단백질 분자를 직접 관찰할 수 있습니다. 또한 수백만개의 단백질 이미지를 분석한다면 원자수준의 고해상도의 분자모형을 제작할 수 있고 이를 통해 단백질의 작용원리를 설명할 수 있습니다. 이번 연구에서 극저온 전자현미경을 활용하여 TLR3의 클러스터를 직접 이미징하여 현상을 증명하고 이를 통해 고해상도의 분자모델을 만들었습니다. 때로는 눈으로 직접 보는 것이 복잡한 문제를 쉽게 설명할 수 있는데, 기존의 세포실험과 생화학실험으로 명확한 설명이 어려웠던 질문을 해결해 보람을 느꼈습니다. 이번 논문에서 다양한 조건에서 현상을 관찰하다 보니 시료에 따라 구조분석에 어려운 경우도 있었지만, 전자현미경을 직접 다루면서 문제를 해결하는 과정과 결과를 만들어가는 과정 모두에서 좋은 경험을 쌓을 수 있었습니다.

4. 이 분야로 진학하려는 후배들 또는 유학준비생들에게 도움이 되는 말씀을 해 주신다면?

구조생물학은 최근 10년동안 엄청 빠르게 변화하고 있습니다. Cryo-EM이라는 기술의 발전은 기존에 x-ray crystallography로 규명하기 어려운 세포막 단백질과 단백질 거대복합체 구조규명을 가능하게 했으며, 실험적 데이터뿐만 아니라 알파폴드, 로제타폴드 등과 같은 기계학습을 통한 단백질 구조예측도 상당한 수준으로 올라와 단백질 구조에 대한 정보가 이전보다 더 방대해지고 있습니다. 그렇기에 앞으로는 단백질 구조를 규명하는 것은 여전히 중요하겠지만, 구조를 활용하는 분야가 많이 활성화가 될 거라 생각됩니다. 특히 CPU나 GPU의 발전으로 컴퓨터를 이용한 분자 시뮬레이션, 단백질 모델링 쪽도 같이 발전하면서 ligand docking와 protein design의 계산속도와 정확도도 날이 갈수록 높아지고 있어 단백질 3차원 구조정보를 활용하는 분야는 더욱 중요해질 것 입니다.

최근에는 코로나 바이러스에 대응하는 백신개발에서 단백질 3차원구조를 활용의 중요성을 확인할 수 있었습니다. 코로나 바이러스의spike 단백질 구조와 환자의 항체와 spike 결합구조를 통해 antigenic site를 찾고 이를 통해 백신설계 전략을 세우고, 백신의 효능과 안정성을 높이는 디자인을 생화학 실험뿐만 아니라 단백질 3차원구조 정보를 활용하여 빠르고 효율적으로 백신을 개발하였습니다. 앞으로 이러한 사례가 누적된다면 단백질 3차원 구조를 활용하는 일은 학계뿐만 아니라 산업체 등 여러 곳에서의 수요가 더 많아질 것 입니다. 그렇기에 단백질 구조를 활용할 수 있는 다른 분야에도 관심을 가지거나 생물학뿐만 아니라 다양한 배경을 가진 사람들이 단백질 구조를 공부하면 좋을 것 같습니다.

저는 이번 연구를 통해서 Cryo-EM을 통해 단백질의 구조를 규명하는 기술을 배웠고 앞으로는 구조규명 외에도 면역 단백질 구조를 이용한 therapuetics분야에도 도전할 예정입니다.

5. 연구 활동과 관련된 앞으로의 계획이 있으시다면?

Pattern recognition receptor, cytokine receptor 등 면역수용체의 구조는 지난 30년간 x-ray crystallography를 통해 많이 규명되었고 이를 통해 우리 몸이 어떻게 감염원을 인식하는지 어떠한 방식으로 신호를 전달하는지에 대한 많은 정보를 제공해주었습니다. 그럼에도 불과하고 여전히 분자수준에서 세포 외 신호를 어떻게 세포 내로 전달하는지에 대해서는 불분명한 것이 많습니다. Signal pathway에 참여하는 단백질과 전달 순서에 대한 downstream pathway는 세포신호 및 생화학연구를 통해 많이 밝혀졌으나 이러한 단백질들이 어떠한 형태와 원리로 신호복합체를 이루어 지는지에 대한 구조적 연구는 부족합니다. 저는 아직까지 풀리지 않은 면역수용체 복합체에 구조에 대한 연구를 남은 학위기간동안 계속해 진행할 예정입니다.

6. 다른 하시고 싶은 이야기들.....

먼저 연구를 지도해주신 이지오 교수님께 감사드립니다. 연구에 대한 꾸준한 열정과 연구과정에서 문제들을 위해 다양한 기술을 제안하고 도전하는 모습을 보면서 연구자로서의 자세를 고민하고 배울 수 있었습니다. 이번 연구가 논문으로 출판되기까지 연구실 구성원 분들의 많은 도움이 있었습니다. 특히 중간에 어려움이 많았던 reporter assay 세팅을 도와주신 정혜진 선생님 그리고 Cryo-EM 서버를 운영하고 Cryo-EM 데이터 프로세싱을 같이 고민해주신 이창준 박사님께 큰 감사의 인사 드립니다. 이번 과정을 바탕으로 앞으로도 꾸준히 좋은 연구를 하는 연구자가 될 수 있도록 노력하도록 하겠습니다.