1. 논문관련 분야의 소개, 동향, 전망을 설명, 연구과정에서 생긴 에피소드

Lineage tracing provides information about the number of progenies of the founder cell, their growing pattern and differentiation status. Recently, many lineage tracing approaches have been developed to track a cellular lineage in diverse cells, tissues and whole organisms.

The early processes in embryogenesis have been studied in the model organisms using direct observation. The complete developmental cellular lineage of C. elegans was reconstructed by using the microscopic observation, leading this study awarded the Nobel Prize in 2002 (Sulston et al. 1983, Dev Biol). After then, many researchers have used direct observation approach for studying cellular lineages during embryogenesis in zebrafish (Kimmel CB and Warga RM. 1986, Science) and fruit-fly (Campos-Ortega and Hartenstein. 1985, Springer-Verlag Berlin Heidelberg) by developing different microscopic techniques. Recently, genetically modified mice (such as Brainbow mice and Confetti mice etc.) have also become the mainstream of genetic lineage tracing studies, using Cre-loxP and FLP-FRT systems (Livet et al. 2007, Nature; Snippert et al. 2010, Cell). These technologies have been used for the expression of the fluorescent proteins or polylox cassette (excisions and inversions), also used as genetic barcode to study the clonal output, cellular diversity and tissues during embryonic development, cell differentiation and tissue regeneration (Pei et al. 2017, Nature).

In addition, CRISPR-Cas9 barcode editing approach with single cell sequencing and genome editing of synthetic target arrays for lineage tracing (GESTALT) technique in animal models (Yang et al. 2014, Nat Commun; McKenna et al. 2016, Science) have been developed for elucidating accurate lineage trees for the early embryonic developmental stages. A new CRISPR based cancer cell lineage tracing method offers to trace real time cancer progression across thousands of cells and reveals the novel insights of cancer metastasis (Quinin et al. 2021, Science). However, all these methods are not applicable to study human embryos because of ethical and technical limitations therefore the cellular dynamics and developmental outcomes of embryonic cells in human remain largely unknown.

Humans are multicellular organisms, developed from a single cell, zygote. The zygote divides, gradually differentiate and form lineages that comprise all tissues in the adult body. During embryonic development, somatic mutations are accumulated in the cell’s genome in each cell division and are always inherited in their progeny. Therefore, somatic mutations can effectively be used as barcodes in lineage tracing studies (Behjati et al. 2014, Nature). By analyzing patterns of mutations based on the shared and the private, which accumulated in cells over their life time from the zygote, we can identify the clonal relationship between cells and thereby reconstruct the lineage trees of embryogenesis (Alemany et al. 2018, Nature).

Somatic mutations, accumulated in cells during their lifetime, enable the tracing of individual cell lineages and the timing of their segregation during embryo development. The cellular lineages in the later stage of embryo development stage must rely on the reconstruction of a large number of clonal samples from various anatomical locations. The timing of differentiation of three germ layers (ectoderm, mesoderm and endoderm) in embryo can be calculated through the phylogenetic tree reconstruction from pure cell types originated from these 3 cell layers. Due to the ethical and the legal issues, it is not possible to collect the various tissue types from the living individuals. To overcome these hurdles, autopsy is the best option, which we can collect diverse cells from different tissue type origins.

Our study explored whole genomes of 334 single-cell clones and targeted deep sequences of 379 bulk tissues from different anatomical locations from seven individuals. Using somatic mutations as an intrinsic barcode, my team lead by Prof. Ji Won Oh in Kyungpook National University School of Medicine, along with collaborator team lead by Professor Young-Seok Ju from KAIST, reconstructed early cellular lineages. We also demonstrated that this approach of using somatic mutation for the reconstruction of the human early embryogenesis is working.

Our result revealed several key characteristics and mechanistic insight of the human embryonic developmental process. First, our study delineated the universal unequal contribution of early cells in the adult tissues that suggested stochasticity of clonal segregation during human development. The two earliest ancestral cells showed unequal contribution in the phylogenies to the entire human body. The embryonic cells began to distribute asymmetrically into tissues for the left and right sides of the body, followed by differentiation into three germ layers, and then into specific tissues and organs.

At the same time, our result highlighted that the mutation rates are higher in the first cell division, but then decrease to approximately one mutation per cell division during later of life and determined the possible molecular timing for emergence of early embryonic cells. Next, we were able to investigate early founder lineages that contributed to adult cell pools in blood and liver tissues, as well as the possible ancestral cell lineage of breast cancer in an individual. Finally, from the mitochondrial DNA (mtDNA) sequences in clones, we identified mtDNA variants and exhibited various levels of heteroplasmy in the fertilized egg.

All these findings are started from donation of the human body. In general, the post-mortem body dissection is mostly related to forensic/medical studies or legal necessities. We dissected various tissues from the whole body of 10 cadavers for culture and clonal expansion. Most of the skin and muscle fibroblasts were succeed in clonal expansion and obtained high quality WGS data.

It was difficult and challenging to get the proper protocols from a donor body, not only due to socio-cultural factors and administrative procedures of each family but the sophisticated experimental environment. Certain donor families refused to donate the whole body or were reluctant to open the body and only wanted to donate skin tissues. While we have overcame this, we learned a lot and struggled many trials and errors, leading us good at this area.

We also found that the patient's physiological and pathological health condition at the time of death, is very important for the clonal expansion experiment. Storage condition of the body after death, post-mortem time period and collection process of tissues are crucial factors to culture cells from the tissue, which is inevitably important to get the sufficient amount of DNA for whole genome sequencing without any possible artifacts.

Fortunately, as our new experimental strategy works effectively, we will focus on the analyses of more clones from more individuals in the future to make the high-resolution map of early human embryogenesis.

Lineage tracing (계통 추적)에 대한 연구는 조상 세포의 자손 수, 성장 패턴 및 분화 상태에 대한 정보를 제공하며, 최근에는 많은 Lineage tracing 접근법들이 다양한 세포, 조직 및 유기체 전체의 세포계통(cellular lineage)을 추적하기 위해 개발되어져 왔습니다. 초기 배아 발생 연구는 유기체 모델을 이용한 직접적인 관찰을 통해 이루어졌습니다. 대표적인 예로, C. elegans를 현미경 관찰법을 이용하여 완전한 수준의 세포발달계통을 재구성하였고, 이 성과는 2002년 노벨상(Sulston et al. 1983, Dev Biol) 수상을 이끌어냈습니다. 그 후 많은 연구자들이 제브라피쉬 (Kimmel CB and Warga RM. 1986, Science)와 초파리 (Campos-Ortega and Hartenstein. 1985, Springer-Verlag Berlin Heidelberg )의 배아 발생 시 세포 lineage를 연구하기 위해, 좀더 기술이 발전된 현미경을 도입하여 직접적인 관찰 접근 방식으로 연구를 진행하였습니다.

최근 이 분야의 주류 연구는 ‘Cre-loxP와 FLP-FRT 시스템 (Livet et al. 2007, Nature; Snippert et al. 2010, Cell)을 활용한 유전자 변형 생쥐 (Brainbow mouse, Confetti mouse 등)’를 이용하는 것입니다. 이러한 기술은 형광 단백질 또는 polylox cassette (절제 및 반전)의 발현을 이용하는 것으로써, 배아 발달, 세포 분화 및 조직 재생 시 clonal output, 세포 다양성 및 장기 등을 연구하기위한 유전적 바코드로 사용됩니다 (Pei et al. 2017, Nature).

또한 동물모델의 초기 배아 발달단계에 대한 정확한 lineage tree (계통수)를 밝혀 내기 위해, ‘단일 세포의 sequencing(서열분석)’과 ‘GESTALT(계보 추적 합성 표적 어레이의 게놈 편집)’ 기법에 의한 CRISPR-Cas9 바코드 편집’ 접근법이 발전되었습니다 (Yang et al. 2014, Nat Commun; McKenna et al. 2016, Science). 특히, 새로운 CRISPR 기반 암세포 lineage tracing 기법은 수천 개의 세포에서 실시간으로 암 진행을 추적하고, 암 전이에 대한 새로운 지식을 제공해 줄 수 있음을 보여줍니다 (Quinin et al. 2021, Science). 그러나, 이러한 방법들은 인간 배아 세포에 대한 세포 역학 및 발달 과정에 대한 연구에 있어서 많은 윤리적, 기술적 제한과 한계로 인해 현재까지도 많은 질문들은 밝혀지지 않은 상태입니다.

인간은 다세포 생물이며, 단일 세포인 수정란으로부터 발달됩니다. 수정란은 성체의 각 조직을 구성하는 계통으로 나뉜 후 점차적으로 분화해갑니다. 이러한 배아 발달 중에, 체성 돌연변이는 각 세포 분열 시 게놈에 축적되고 자손에게 유전됩니다. 따라서 이러한 ‘체성 돌연변이’는 lineage tracing 연구에서 효과적인 ’바코드’ 역할을 하게 됩니다 (Behjati et al. 2014, Nature). 즉, 수정란으로부터 세포에 평생을 통해 축적된 돌연변이 패턴들을 분석하면 배아세포들 사이의 관계를 파악할 수 있고, 이를 통해 배아 발생 lineage trees (Alemany et al. 2018, Nature)를 재구성할 수 있게 됩니다.

일생 동안 세포에 축적된 체성 돌연변이는, 개별 세포 lineage tracing과 배아 발달 과정중의 분리 시기를 파악할 수 있으나, 배아 발달 단계 후반의 세포 lineage는 다양한 해부학적 위치에서 많은 수의 샘플을 clonal expansion하여야만 재구성할 수 있습니다. 배아에서 3가지 germ layer (외피, 중피, 내피)로의 분화 시기는, 이들 세포층으로부터 유래한 단일의 세포 유형에서 재구성된 phylogeny tree를 통해 계산됩니다. 따라서 윤리적, 법적 문제로 인해 살아있는 개인으로부터 다양한 조직을 채취할 수는 없는 이러한 한계를 극복하기 위해서는 다양한 조직형 기원에서 다양한 세포를 채취할 수 있는, 부검이 가장 최선의 방법입니다.

본 연구는 총 7구의 시신으로부터 각각 다른 해부학적 위치의 조직을 확보하고, 334개의 단일 세포 클론을 배양한후 그로부터 전체 게놈을 분석하고, 추가로 379개의 bulk 조직으로부터 심층 서열분석을 하였습니다. 저의 지도교수님이신 경북의대 오지원 교수님께서는 KAIST 주영석 연구팀과 함께 체성 돌연변이를 생물학적 바코드로 사용하여 초기 세포 혈통을 재구성하였습니다. 이를 통해 인간의 초기 배아의 재구성을 위한 체성 돌연변이를 사용하는 접근법이 효과가 있다는 것을 증명하였습니다.

이들 결과들은 인간의 배아 발달 과정의 몇 가지 핵심적인 특성과 기계론적 insights들을 보여주었습니다. 첫째, 인간의 발달 과정 동안 성체 조직 내 초기 세포가 보편적으로 동일하게 분화에 기여하는 것은 아닐 것이며, 이는 초기 두 조상세포가 전체 인체에 대한 lineage 유전에 불균등한 기여와 함께 비대칭적 분열을 보였다는 것을 보여줍니다. 배아세포는 신체의 좌우를 위한 조직으로 분화하기위해 비대칭적으로 분포되어 지는데, 세 개의 germ layer로 분화한 다음, 특정 조직과 장기로 분화하기 시작한 것으로 보여집니다. 동시에, 돌연변이 비율이 첫 번째 세포분열에서 더 높지만, 그 후에는 세포분열당 대략 한 개정도의 비율로 감소한다는 것을 밝혔으며 초기 배아세포의 분자학적 출현 가능 시기를 밝혔습니다. 다음으로 혈액과 간 조직에서 성인 세포들을 구성하는 초기 창시 lineage 를 조사할 수 있었으며, 또한 유방암 lineage 상의 조상 세포 혈통을 조사할 수 있었습니다. 마지막으로, 세포 클론 들로부터 얻은 미토콘드리아DNA (mtDNA) 서열의 분석을 통해 mtDNA 변형을 식별하였고, 수정란에서는 다양한 수준의 이형성 (heteroplasmy)을 가짐을 보았습니다.

이 모든 연구결과는 “시신 기증” 으로부터 시작되었습니다. 일반적으로 사후 시신 부검은 대부분 법의학/의학 연구 또는 법적 필요성과 관련이 있었고, 세포 배양과 clonal expansion을 위해 10구의 시신으로부터 전신의 다양한 조직을 채취하였습니다. 대부분의 피부와 근육으로부터 섬유 모세포 clonal들의 expansion에 성공하여 고품질의 WGS 데이터를 얻을 수 있었습니다.

시신 기증은 각 가정의 사회문화적 요인으로 인한 가족으로부터의 적절한 동의를 얻는 것, 까다로운 행정 절차로 인해 정교한 실험환경을 요하는 적절한 protocol을 얻는 것 등이 매우 어려웠습니다. 일부 기증자 가족들은 장기기증을 거부하기도 하고, 또는 몸을 열기를 거부하여 피부 조직만 기증하기를 원하기도 하였습니다. 이러한 모든 어려움들을 극복하기 위해 시행착오를 겪으며 많은 것을 배웠고 이는 본 연구를 성공으로 이끄는데 필수적이며 중요한 과정이었습니다.

또한 사망 당시 환자의 생리학적, 병리학적 건강 상태가 clonal expansion 시 매우 중요하다는 것을 확인하였습니다. 즉, 사망 후 사체의 보관 상태와 사후 기간, 신체 조직 채취 과정이 조직으로부터 세포를 성장시키는 데 중요한 요소인데, 이 기간 중 생길 수 있는 인공물 없이 전체 게놈 서열 분석을 위한 충분한 양의 DNA를 얻는 것이 필수적 조건이었습니다. 다행히도 우리의 새로운 실험 전략이 효과적으로 작동함에 따라 추가 연구에서는 초기 인간 배아 발생의 고해상 지도를 만들기 위해 더 많은 개인으로부터 더 많은 클론을 분석하는 것에 초점을 맞출 예정입니다.

2. 연구를 진행했던 소속기관 또는 연구소에 대해 소개 부탁드립니다.

Our G1’s lab (http://g1phase.com/) was established in March 2016 under the supervision of Prof. Ji Won Oh. Ever since, we have conducted the cadaver dissection to focus on the studies of early embryogenesis using cellular lineage tracing in human and animal models. Until now, we have conducted several cadaver dissections, and many other animal including mice, rats, and pigs to reveal the specification and the commitment of embryonic cells during the differentiation and organogenesis process. In addition, our lab has focused on the various studies on lineage of skin stem cells including hair biology, which are being actively conducted through the differentiation process of skin stem cells. Many students and post-doc researchers, including me, are enjoying the research activities in the self-motivated academic atmosphere.

저희 G1’s lab(http://g1phase.com/)은 2016년 3월 오지원 교수님의 지도하에 설립되었습니다. 그 이후로 저희 연구실에서는 인간 및 동물 모델에서의 세포 계통 추적방법을 사용하여 초기 인간배아 발생 연구에 좀더 초점을 맞추기 위해 기증된 시신 해부를 수행하였습니다. 지금까지 ‘분화 및 신체 각 기관이 형성되는 동안 배아 세포의 특정화 및 commitment’를 설명하기 위해 마우스, 쥐 및 돼지를 포함한 여러 동물들의 사체 및 cadaver 해부도 진행하였습니다. 또한, 본 연구실에서는 피부줄기세포의 분화과정을 통해 활발히 진행되고 있는 모발생물학을 비롯하여 피부줄기세포 lineage 분석에 대한 다양한 연구에 집중하고 있습니다. 저를 포함한 박사 후 연구원분들과 많은 학생분들께서 의욕이 넘치는 학업 분위기에서 연구 활동을 즐기고 있습니다.

3. 연구활동 하시면서 평소 느끼신 점 또는 자부심, 보람

Developmental biology enquires about the fundamental processes, how multicellular organisms grow and develop. With the development of science and technology, this field of study is also developing at an amazing speed. How a human develops from a single fertilized egg and differentiates to a fully-grown adult is a fundamental question to humanity. The details of this process remain largely unknown due to ethical challenges of studying human embryos. Many researchers are studying on it and I am overwhelmed to get a chance to study on it.

There are many biological questions about human embryo development, as well as many wonderful discoveries and studies linking them. In the future, there will be an era where more lineage tracing platforms and the emerging technologies will be utilized to understand development and combat diseases in human. It is my great opportunity and fortune to work on it and I would like to do my best to continue the meaningful research on this subject.

발달 생물학은 다세포 유기체가 성장하고 발달하는 기본 과정에 대해 연구하는 학문입니다. 과학 기술의 발전과 함께 이 분야도 놀라운 속도로 발전하고 있습니다. “인간이 하나의 수정란에서 어떻게 발달하여 다 자란 성체로 분화하는가”는 인류의 가장 근원적인 질문 중 하나입니다. 이 과정의 세부사항은 인간 배아 연구의 윤리적 문제로 인해 잘 알려지지 않았습니다. 현재 많은 연구원들이 그것에 대해 연구하고 있으며, 저 역시 연구할 기회를 얻게 되었을 때 크게 압도되었던 것이 사실입니다.

실제로 인간 배아 발달에 관한 많은 생물학적 질문과 이를 연결하는 많은 놀라운 발견의 연구들이 있습니다. 미래에는 이러한 인간 배아 발달을 이해하고 이와 관련된 질병을 퇴치하기 위해 더 많은 혈통 추적 플랫폼과 신기술을 활용하는 시대가 올 것입니다. 이 일을 하게 된 것은 저에게 큰 기회이자 행운이며, 이 주제에 대한 의미 있는 연구를 계속하기 위해 최선을 다하고 싶습니다.

4. 이 분야로 진학하려는 후배들 또는 유학준비생들에게 도움이 되는 말씀을 해 주신다면?

The reconstruction of phylogenetic trees (Lineage tracing) requires both the highly advanced wet experimental tools (clonal cell expansion, laser capture microdissection, organoid, iPS and NGS works) and the cutting-edge computational analysis (genomic analysis based on bioinformatics). Thus, it is important to have the adequate knowledge about not only anatomy, molecular and cellular biology, but also mathematics, and computer. Since it requires vast knowledge in different fields, it is very difficult but attractive and challenging at the same time. Of course, finding the good collaborator, who have complementary skills that you may not have, is critical. Thus, it is a place where students from various backgrounds can work together. Based on my experience, I think the most important thing is not to give up while conducting research and you should be enthusiastic in any types of work. The most critical point is to have an ability to create a fundamental and significant question and study them deeply for an answer with the tools you can utilize.

Lineage tracing(계통 추적)을 이용한 phylogenetic trees를 재현하는 연구는 고도로 발전된 wet 실험(클론 세포 확장, 레이저 캡처 미세 해부, 오가노이드, iPS 및 NGS 작업)들과 최첨단 컴퓨터 분석(생물정보학 기반 게놈 분석)이 모두 필요합니다. 따라서 해부학, 분자 및 세포생물학 뿐만 아니라 수학, 컴퓨터에 대한 적절한 지식을 갖는 것이 중요합니다. 다양한 분야의 방대한 지식을 필요로 하기 때문에 어렵지만 동시에 매력적이며 도전적입니다. 물론, 여러분들이 가지고 있지 않을 수도 있는 보완적인 기술을 가진 좋은 협업팀을 찾는 것도 중요합니다. 따라서 다양한 배경을 가진 학생들이 함께 일할 수 있는 곳이므로 제 경험에 비추어 볼 때 가장 중요한 것은, 연구를 하면서 포기하지 않고 어떤 일이든 열정적으로 임하는 자세라고 생각합니다. 가장 핵심적인 것은 근원적이면서도 의미 있는 질문들을 만들고 적용할 수 있는 도구로 답을 찾기 위해 깊이 사고하고 연구하는 능력을 갖는 것입니다.

5. 연구활동과 관련된 앞으로의 계획이 있으시다면?

Currently, in this study, we have discovered various somatic mutations to construct single-cell clonal lineages from normal human cells and reconstruct the phylogenetic tree. We have elucidated the asymmetric contribution of early embryonic cells and cellular dynamics in three germ layers from adult tissues.

To expand this work to the other species and mammals, we have produced the meaningful results from pigs, mice and rats. There are still many unanswered questions. In addition to the study of the animals, in the future, we plan to analyze the genomic data of human normal cells more deeply at various spatio-temporal points of embryonic development to understand the development process of each organ in our body in more detail. Presently, we have obtained massive clones, and through their analysis, we plan to further analyze the precise temporal sequence to find the cellular contribution to the development of organs during human embryogenesis.

현재 이 연구에서 우리는 정상 인간 세포로부터 단일 세포 클론 계통을 구성하고 phylogenetic tree를 재구성하기 위한 다양한 체세포 돌연변이를 발견했습니다. 또한 성인 조직의 초기 배아 세포의 비대칭 기여와 3개의 세포층(three germ layer)에서 세포 역할을 설명하였습니다. 이 작업을 다른 종과 포유류로 확장하기 위해 돼지, 생쥐 및 쥐에서 의미 있는 결과를 얻었습니다.

여전히 풀리지 않은 많은 질문들이 이 분야에 산재해 있습니다. 동물 연구 외에도 우리 몸의 각 기관의 발달 과정을 더 자세히 이해하기 위해 배아 발달의 다양한 시공간적 시점에서, 인간 정상 세포의 게놈 데이터를 더 깊이 분석할 계획입니다. 현재 저희는 사람 시신으로부터 대규모의 클론을 얻었고, 그들의 분석을 통해 인간 배아 발생 동안 내부기관의 발달에 대한 세포 기여를 찾기 위해 좀더 정확한 시간적 서열을 밝히기 위한 분석을 진행할 계획입니다.

6. 다른 하시고 싶은 이야기들....

I would like to express my sincere gratitude to my advisors, Prof. Ji Won Oh, and Prof. Dong Sun Kim, Department of Anatomy, Kyungpook National University for guiding me to complete this thesis. I also deeply appreciate the contribution of Prof. Young Seok Ju, Dr. Seongyeol Park, and Dr. Ryul Kim, Cancer Genomic lab, KAIST for helping us in developing, actively supporting the research, and performing bioinformatics analysis. I would also like to extend my thanks to all the donors and their families, co-authors of KNU and KAIST for their help and support.

Nonetheless, it would be difficult to achieve without the support of my family. I would be grateful to my parents and supportive husband, Sanjeeb Shrestha, Ph.D. Not only as a partner but also as a researcher, he always encouraged and supported me. And finally, I would like to thank all my friends for their motivation.

이 논문이 완성될 수 있도록 지도해주신 저의 지도교수님이신 오지원 교수님과 김동선 교수님께 진심으로 감사드립니다. 또한 연구를 적극 지원하고 생물정보학적 분석을 수행하기 위해 도움을 주신 KAIST 암유전체 연구실 주영석 교수님과 박성열 박사님, 김률 박사님의 노고에도 감사드립니다. 연구에 많은 도움과 지원을 해 주신 경북대학교 의과대학과 KAIST의 공저자, 기증자 및 그 가족들에게도 감사의 인사를 전합니다.

무엇보다도 가족들의 도움이 없었다면 이러한 연구 결과는 이루기 어려웠을 것입니다. 특별히 부모님과 남편인 Sanjeeb Shrestha 박사에게 감사드립니다. 파트너로서 뿐만 아니라 연구원으로 서도 항상 저를 격려하고 지원해 주었습니다. 마지막으로 항상 응원해 준 모든 친구들에게 감사의 말을 전하고 싶습니다. (번역: 전미숙 박사, 박정민 연구원)