1. 논문관련 분야의 소개, 동향, 전망을 설명, 연구과정에서 생긴 에피소드

Methylated RNA의 존재는 40여년 전부터 알려져 있었지만, mRNA에 일어나는 chemical modification이 mRNA의 biological function에 영향을 준다는 사실은 최근에 와서야 밝혀지고 각광을 받게 되었지요. 제게 mRNA 의 reversible chemical modification이 존재하고 다양한 기능이 있다는 사실은 크게 흥미로웠고, embryonic stem cell에서는 다른 group들에서 연구를 수행하였지만, nervous system에서는 아직 연구가 전혀 되어 있지 않았기 때문에 연구를 시작하게 되었습니다.

m6A RNA modification은 RNA에 일어나는 100여 종류의 chemical modification 중에서 가장 흔하게 발견되는 modification 입니다. 다행스럽게도 m6A를 mRNA에 붙여주는 enzyme complex인 Mettl3와 Mettl14 protein의 존재가 몇 년 전에 알려지게 되었습니다. 그래서 저희 group은 embryonic neural stem cell에서 Mettl14 conditional knockout을 이용해, m6A modification 을 없앤 다음에 stem cell behavior와 전체 brain development의 변화를 관찰하기로 하였습니다.

1) 천천히 행동하는 neural stem cell

Radial glial cell (RGC)은 embryonic brain development 동안 가장 주요한 neural stem cell 입니다. 긴 radial process를 지닌 이 세포들은 이 process를 이용해서 새로 만들어진 neuron들이 이동하기 때문에 과거에는 neuronal migration을 support하는 세포로 생각했었습니다. 이후에 이 radial glial cell들이 발달하는 대뇌에서 대부분의 neuron, astrocyte 그리고 oligodendrocyte들을 다 만들어낼 수 있는 origin이라는 것이 밝혀졌지요. RGC들은 여러 번의 세포분열을 통해서 daughter cell들을 생산해 내는데, 처음에는 deep layer neuron, upper layer neuron, 그리고 이후에는 astrocyte와 oligodendrocyte progenitor들을 순서대로 만들어내고, 아기가 태어난 이후에는 대부분의 brain region에서 depletion되게 됩니다. 이때 남게 되는 일부의 neural stem cell들을 우리가 adult neural stem cell이라고 부르지요.

m6A RNA modification을 제거한 Mettl14 knockout mouse를 분석하면서 저희가 가장 놀라웠던 점은 정상 생쥐에서 이미 depletion 되어 있는 RGC들이 생후에도 계속 존재한다는 점이었어요. 외형상 Mettl14 knockout mouse의 brain은 생후에도 embryo에서 볼 수 있는 RGC와 다른 neural progenitor의 layer가 그대로 남아있었습니다. 그리고 이 시기에는 이미 후기 RGC들이 만들어내는 astrocyte들이 많이 존재하여야 하는데, mutant의 RGC들은 여전히 초기에 만들어내는 neuron 들을 만들어내고 있었어요. 이러한 결과를 토대로m6A RNA modification이 없으면 brain development의 temporal progress가 매우 느려진다는 결론을 내릴 수 있었습니다. 또한 RGC들이 특이적으로 보이는 interkinetic nuclear migration이라는 움직임과 cell cycle의 속도도 모두 느려져 있다는 것을 알게 되었지요.

2) m6A가 달려있는 특별한 mRNA 들

이러한 RGC들의 행동 변화를 설명하려면, m6A가 달려있는 mRNA들이 과연 어떤 것들인지 알아야 할 필요가 있었습니다. 따라서 저희는 mouse embryonic brain을 모아서m6A가 달린 mRNA들을 잡아당겨서 떨군 다음에, next generation sequencing으로 그것들이 무엇인지를 살펴보았어요(m6A-sequencing). 흥미롭게도, 전체 mRNA 들의 10% 정도가 m6A tag이 달려 있었고, 많은 mRNA들이 transcription factor, 혹은 transcription을 조절하는 것들이었어요. 특히 stem cell maintenance와 cell cycle, 그리고 neuronal differentiation을 조절하는 인자들이 많이 있었습니다. 이러한 mRNA들의 발현 양상이 변화한다면, 앞에서 살펴본 neural stem cell의 변화들이 상당부분 설명될 수 있기 때문에 매우 고무적이었지요.

그렇다면 m6A 가 달려있게 되면 mRNA에 어떤 변화를 일으키는 것일까요? 일단 전체 transcriptome의 변화를 살펴보기 위해서 정상 생쥐와Mettl14 knockout 생쥐의 대뇌를 갈아서 RNA-seq을 해 보았어요. 신기하게도 upregulation 된 mRNA들은 대부분 m6A tag 을 가지고 있는 것이었고 downregulation된 것들은 별로 없었습니다. 따라서m6A tag 이 있는 mRNA 들이 더 stable해진 것이 아닌가 생각하게 되었고, neural progenitor에서 RNA lifespan을 측정해 보니 많은 m6A tagged mRNA, 특히 stem cell maintenance와 cell cycle 관련한 mRNA의 lifespan이 매우 길어진 것을 알게 되었습니다. 즉, 이러한 mRNA들이 더 길게 존재하기 때문에 neural stem cell이 더 오래 유지되고, cell cycle이 더 늘어지게 되지 않았을까 생각할 수 있었습니다.

3) 인간 특이적인 m6A pattern

그 다음에는 human brain의 초기 발달 단계를 시험관에서 재연할 수 있는 model인 3D forebrain organoid와, 낙태된 태아의 human cortex 시료들을 가지고m6A-sequencing을 해 보았어요. 매우 흥미로운 것은, 생쥐에는m6A가 달려있지 않지만 인간에게만 달려있는 mRNA들을 분석해본 결과 상당수가 정신질환에 관련된 유전자들이었다는 것이었어요. 이에 비해 생쥐에도m6A가 달려있고 인간에게도 달려있는 mRNA들을 인간 질병유전자 데이터베이스와 비교해보면 상당수가 cancer에 관련된 유전자들이라는 점에서, cell cycle을 조절하는 부분에 있어서는 생쥐와 인간이 유사한m6A 을 통한 조절을 가지고 있다는 점도 알게되었지요. 아직 분자 수준의 정확한 의미는 제가 잘 모르지만, 진화 과정에서 정신 질환에 관련된 mRNA들이 보다 정교하게 조절될 필요가 있기 때문에m6A RNA modification에 의해 그 발현이 보다 여러 차원에서 조절되고 있는 것이 아닐까 추정해봅니다.

4) m6A 에 의한 유전자 발현 미세 조정 (fine-tuning of gene expression)

m6A가 달리게 되면 mRNA가 더 빨리 부서지고, 이것이 없으면 mRNA 수명이 상당히 늘어나게 됩니다. 저희의 결과로는 cell fate transition에 중요한 key transcription factor mRNA들은 상당수 m6A가 달려있고, house keeping gene들은 전혀 m6A가 달려있지 않았어요. 그렇다면 neural stem cell은 처음부터 mRNA를 안 만들면 되지, 이렇게 만들어놓고 부셔버리는 낭비적인 system을 사용하고 있을까요?

Neural stem cell이 분화하는 daughter cell들을 만들어내면 daughter cell들은 단계적으로 분화하면서 다른 cell type으로 빠르게 변하게 됩니다. 이 과정은 cell fate를 결정하는 transcription factor들이 순차적으로 변화하면서 일어나지요. 즉, transcription factor들의 expression이 다음 단계로 빠르게 넘어갈 필요가 있습니다. Structural gene들이나 house keeping gene들에 비해 transcription factor들은 더 적은 양의 발현으로도 많은 종류의 downstream 유전자들을 키거나 끌 수 있기 때문에, 많은 양을 발현하는 것보다는 유전자 발현이 켜지고 꺼지는 속도가 더 중요할 수 있지요. 이런 경우 일단 mRNA를 transcription을 시켜놓고, m6A를 통해 지속적으로 부셔버리는 과정을 통해 유전자 발현을 더 빠르게 켜고 끌 수 있을 것으로 보입니다 (아래 그림 참조).


이러한 조절 기작은 특히 cell fate transition이 일어나는 stem cell의 초기 분화 과정에 중요 할 것으로 생각됩니다. 실제로 발달하는 embryonic brain에서 single cell RNA-seq을 해 보면, neural stem cell들에서 유난히 Mettl14의 발현이 높은 것을 확인할 수 있었습니다. 즉, neural stem cell 내부에서 특정 종류의 mRNA 들을 m6A를 통해 조절하는 system이 유달리 발달되어 있는 것이지요.

5) 남은 궁금증들

저희의 연구를 통해 m6A RNA modification이 정상적인 brain development과 neural stem cell function에 매우 중요하다는 사실을 알 수 있었습니다. 사실 RNA lifespan을 조절하는 기작 말고도 mRNA를 조절하는 다양한 biological pathway들이 m6A에 의해 조절될 것으로 생각하지만, 그 구체적인 사항에 대해서는 brain development에 있어서 아직 명확하게 연구하지 못했습니다. 그리고 성숙한 신경세포의 경우 mRNA가 axon이나 synapse같은 먼 곳으로 운송되는 현상들이 일어나는데, 이러한 과정들에 m6A RNA metabolism 이 중요할 것으로 의심하고 있습니다. 또한 기존에 존재하던 m6A methylation tag들이 demethylase에 의해 떨어져나가는 기작도 있을 것으로 생각하는데, 어떠한 biological stimuli가 dynamic하게 m6A landscape을 바꿔줄 수 있을지 아직은 잘 모르고 있습니다. 마지막으로 Mettl3-Mettl14 효소가 특정한 mRNA들에만 특이적으로 m6A를 달아주는 기작이 무엇인지도 꼭 규명되어야 할 숙제입니다.

2. 연구를 진행했던 소속기관 또는 연구소에 대해 소개 부탁 드립니다.

제가 있는 Dr. Hongjun Song 실험실에서는 adult neural tissue에서 일어나는 DNA methylation/demethylation mechanism과 그것의 biological meaning에 대해 오랫동안 연구해 왔습니다. 따라서 dynamic DNA methylation/demethylation이 adult neural stem cell behavior에 기능하는 방식을 어떻게 연구해 가는지 많이 배울 수 있었습니다. 이러한 배경은 제가 RNA methylation 연구를 시작하고 수행하는데 큰 도움이 되었습니다. Johns Hopkin University에 있던 실험실이 연구 중간에 University of Pennsylvania로 옮기게 되어서 약간 어려움이 있었지만, 서로 다른 학교의 연구 환경들을 둘 다 지켜볼 수 있었던 것은 좋은 경험이었습니다.

3. 연구활동 하시면서 평소 느끼신 점 또는 자부심, 보람

이번 논문에 공동 제일 저자로 참여한 Francisca와 Caroline은 둘 다 제가 rotation 때부터 지도했던 대학원생들입니다. 실험실에 들어온 학생들을 제가 진행하는 연구에 관심을 가지도록 독려하고, 하나씩 가르쳐서 발전시키는 과정들이 매우 즐겁고 보람 있었습니다. 덕분에 저도 이번 프로젝트를 효과적으로 진행할 수 있었고, 학생들이 큰 걱정없이 졸업하고 다음 단계로 나아갈 수 있게 되어 매우 기쁩니다.

4. 이 분야로 진학하려는 후배들 또는 유학준비생들에게 도움이 되는 말씀을 해 주신다면?

연구를 하다 보면 생각대로 연구가 잘 진행되는 시기가 있는가 하면, 많은 시간과 정성을 기울여도 진전이 잘 안 되는 시기가 자연스럽게 있습니다. 그때마다 너무 실망하지 않고 꾸준히 노력하는 것이 생물학 연구에서는 가장 중요한 것 같습니다.