1. 논문관련 분야의 소개, 동향, 전망을 설명, 연구과정에서 생긴 에피소드

간암은 세계적으로 여섯 번째로 흔하게 진단되고 세 번째로 높은 치사율을 가진 암으로 우리나라 남성 암 사망원인의 1~3위를 차지할 정도로 흔하고 무서운 암입니다. 간암은 주로 viral hepatitis, alcoholic liver disease, 그리고 autoimmune hepatitis에 의하여 초래되는 만성염증과 밀접하게 관련되어 있습니다. 하지만 진행된 상태의 간암은 치료가 어렵고 치명적임에도 불구하고 많이 진행되기 전까지는 자각증세가 거의 없어 조기 발견이 어려우므로 환자의 30~40%에서 조기진단에 의한 외과적 수술 및 간 이식과 같은 치료를 받는 실정입니다. 따라서 간암을 조기에 진단하고 효과적인 치료방법을 개발하는 것은 간암 치료에서 중요합니다. CD133은 막전이 당단백질 (pentaspan transmembrane glycoprotein)로 간암을 비롯하여 다양한 종류의 암세포에서 발견되는 암줄기세포 (cancer stem cell)의 특성을 가지고 있습니다. CD133 발현이 높은 세포는 colony-forming, 세포성장율과 종양발생율이 높으며, 임상적으로 간암 환자에서는 CD133 발현이 높은 환자가 낮은 환자보다 생존율이 낮고 높은 재발율을 보입니다. 이처럼 CD133이 종양의 개시, 전이와 약물저항성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 특히 간암환자에서 높은 종양 생성율과 낮은 진단 및 재발과 관련이 있습니다. 따라서 간암을 비롯한 다양한 종류의 암에서 CD133 발현을 조절한다면 암 치료와 재발율을 감소시킬 수 있습니다. 하지만 현재까지는 암줄기세포의 표지자적인 역할로 CD133이 종양형성에 관련되어 있다는 연구가 주로 수행되었으며, CD133 발현과 관련된 연구는 거의 진행되지 않았습니다.

본 연구는 STAT3가 전사인자로써 암의 개시와 유지 및 전이에 중요한 인자로 알려져 있으며, CD133은 줄기세포로써의 역할만 알려져 있을 뿐 발현과 관련되어서는 전혀 알려진 것이 없습니다. 특히 간암 환자의 조직과 혈액에서 활성화된 STAT3와 HIF-1 및 CD133의 발현과 IL-6와 IL-23 농도가 증가되어 있다는 사실에 주목하여 이들의 관련성에 대하여 주목하여 간암세포주와 간암 동물모델을 이용하여 CD133 발현이 암미세환경에서 STAT3에 의하여 조절되며, 또한 저산소상태에서 발현되는 HIF-1 도 CD133의 발현에 중요한 역할을 하고 있다는 것을 처음으로 규명하였습니다.

이러한 결과는 암미세환경에서 간암을 비롯하여 활성화된 STAT3와 CD133 발현이 증가된 암에서 STAT3를 선택적으로 표적으로 하여 암을 치료할 수 있는 항암치료의 새로운 전략이 될 수 있는 가능성을 열었습니다. 실험 중 가장 어려웠던 점은 세포수준에서 STAT3에 의하여 CD133의 발현이 조절된다는 사실을 규명하기 위해서는 간암 세포주에서 다량의 CD133-negative와 CD133-positive 세포를 sorting하는 과정과 후속 실험으로 충분한 세포를 얻는 과정이 특히 힘들었습니다. 또한 STAT3 억제제를 이용한 in vivo 실험으로 기존의 예상되는 실험결과를 얻기까지 revision기간을 연장하며 기존의 연구결과를 반복하고 확인하는 과정과 추가실험을 통하여 가설을 확인하는 과정이 어려웠습니다.

2. 연구를 진행했던 소속기관 또는 연구소에 대해 소개 부탁 드립니다.

본 연구실은 서울대학교 의과대학(연건캠퍼스) 약리학교실 예상규 교수님의 종양줄기세포 & 암미세환경 (Cancer Stem Cells & Tumor Micrenvironment; http://www.stat3.org/index2.asp) 연구실로 종양의 발생과 성장, 전이, 항암제 내성 및 면역회피 기전에 중요한 전사인자로 알려진 STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) 단백질의 생체 내 기능과 새로운 타깃을 찾는 연구를 수행하고 있습니다.

최근에는 종양줄기세포 (cancer stem cells)의 새로운 바이오마커를 발굴하여 그 특성을 규명하며, STAT3 단백질의 새로운 기능이 질병과 연관하여 뇌의 Microglia와 Neuron과의 상호신호전달, GBM에서의 약물 타겟 발굴, 염증성대장염, 약물저항성 유방암, 감염성 폐질환등과 같은 일에 관심을 가지고 있으며, 특히 종양을 둘러싼 주변 미세환경 (종양미세환경)을 구성하는 면역세포와 종양의 상호작용에 대하여 새롭게 초점을 맞추어 연구하고 있습니다. 이러한 연구를 통하여 면역이상 질환 및 종양의 발생과 전이 기전을 밝히고 이를 표적으로 하는 새로운 치료제를 개발하는 것을 궁극적인 목표로 하고 있습니다.

3. 연구활동 하시면서 평소 느끼신 점 또는 자부심, 보람

저희 연구실은 종양세포주와 동물모델을 이용하여 종양미세환경에서 종양의 발생과 성장, 전이, 항암제 내성 및 면역회피 기전에 대한 STAT3의 역할을 규명하는 연구를 진행하고 있습니다. 그리고 의과대학의 특성상 기초연구의 결과가 실제 임상에도 일치하는지 인체 시료를 이용하여 확인할 수 있으며, 반대로 인체 시료로부터 확인된 자료를 토대로 기초연구를 수행할 수도 있습니다. 이렇게 수행하여 얻은 결과는 바로 새로운 암을 진단하거나 치료법을 개발하는데 사용될 수 있으며, 중개연구 (translational research)로 적용되어 더욱 우수한 결과를 얻을 수도 있습니다. 이처럼 귀중한 인체 시료를 기증한 환자분들과 그 가족분들의 뜻을 받들어 조기에 암을 진단하고 치료하는 항암제를 개발하는 것이 저희 연구실의 목표이며, 또한 저의 궁극적인 연구목표입니다.

4. 이 분야로 진학하려는 후배들 또는 유학준비생들에게 도움이 되는 말씀을 해 주신다면?

기존에 알려진 연구결과를 바탕으로 새로운 아이디어를 창출하여 가설을 정립하고 이것을 세포수준에서 확인하여 가설을 증명하기에는 많은 반복적인 실험과 실패라는 과정에 의하여 나타나는 결과이므로 초기의 실패에 좌절하지 말고 항상 도전하는 마음으로 연구에 임하기를 바랍니다. 세포수준에서 규명한 연구결과를 동물모델에 적용하여 분석하고 또한 가능하면 환자시료를 이용하여 분석하고 기존의 발표된 데이터베이스를 통한 최종적인 검증으로 연구한 결과가 실제로 암환자의 치료에 도움이 될 수 있다고 확신하고 연구자로서의 이러한 과정이 비록 힘들지만 아무나 할 수 없는 선택된 연구자라 생각하고 스스로에게 항상 용기와 격려를 주어 즐거운 마음으로 연구에 임하시길 바랍니다.

5. 연구활동과 관련된 앞으로의 계획이 있으시다면?

본 연구의 결과는 암줄기세포의 바이오마커로 알려진 CD133 발현조절에 대한 분자기전을 규명한 것으로 암치료를 위한 선택적 표적치료의 가능성을 제시하는 기초연구로써 앞으로도 종양에서 활성화된 STAT3를 표적으로 하는 후보물질을 발굴하고 더욱 나아가 임상적으로 적용할 수 있는 새로운 항암제를 개발하는 연구를 지속해 나갈 것입니다.

6. 다른 하시고 싶은 이야기들....

이 연구를 마무리 짓기까지 제가 연구를 수행하는데 많은 도움을 주신 분들, 특히 공동 교신저자로 참여해 주신 연세대 이윤한 교수님과 revision실험에 큰 도움을 주신 KAIST의 정원일 교수님, 원자력의학원 박인철 박사님, 최경주 박사님, 이은희 박사에게 지면으로나마 감사의 말씀을 꼭 드리고 싶습니다.

이번 'STAT3-mediated CD133 Upregulation Contributes to Promotion of Hepatocellular Carcinoma' 논문은 보건복지가족부와 미래창조과학부가 추진하는 기초연구사업 (암정복추진연구개발 및 선도연구센터, 중견연구자지원)의 지원으로 수행되었습니다.

[연구 개요]

그림 1. 간암 조직에서 활성화된 STAT3와 HIF-1 및 CD133 발현 증가.
간암 환자의 종양조직 (A)와 DEN에 의하여 간암을 유발한 동물의 종양간조직 (B)에서 비교대조군과 비교하여 활성화된 STAT3와 HIF-1 및 CD133 발현이 증가되었다. 그리고 정상인 혈액과 비교하여 간암환자의 혈액에서 IL-6의 농도가 증가되어 있었다 (C).

그림 2. 간암세포에서 IL-6 자극과 저산소상태에서 CD133 발현의 증가.
간암 환자의 혈액에서 IL-6의 농도가 증가되어 있으므로 CD133 발현에 대한 IL-6의 작용을 확인하기 위하여 간암세포에 IL-6를 처리하여 CD133의 발현을 확인하였다. 간암세포에서 CD133의 전사활성 (A)과 발현이 IL-6 자극에 의하여 활성화된 STAT3 의존적으로 증가 (B-E)되었으며, 이러한 증가 현상은 AG-490 또는 sorafenib 처리에 의하여 감소하였다. 또한 CD133의 발현이 저산소상태 (hypoxia)에서 HIF-1 의존적으로도 증가하였다 (F). 이러한 CD133의 발현은 IL-6에 의한 STAT3 활성화와 저산소상태에서 HIF-1 의 발현이 함께 작용하는 경우 더욱 증가하였다 (G). 이러한 결과는 CD133의 발현이 저산소상태의 암미세환경(tumor microenvironment)에서 더욱 증가될 수 있으며, 특히 IL-6/pY-STAT3와 HIF-1 의존적으로 조절될 수 있다는 것을 의미한다.

그림 3. IL-6 자극에 의한 CD133의 줄기세포 특성 증가.
CD133의 기능을 확인하기 위하여 CD133-negative와 CD133-positive 세포를 분리하여 IL-6를 처리하여 변화되는 CD133의 발현과 기능을 확인하였다. 간암세포에 IL-6를 자극하였을 때 CD133의 발현과 함께 줄기세포의 특성을 유지하는 것으로 알려진 전사인자의 발현이 증가하였으며 (A, B), sphere forming capacity와 sphere size가 현저하게 증가하였다 (C). 그리고 IL-6 자극에 의한 CD133 발현 증가는 세포분열을 촉진하는 단백질인 cyclin A와 D1의 발현을 증가시켰으며, 반대로 세포분열을 억제하는 암 억제단백질인 p21의 발현을 감소시켰다. 이러한 결과는 CD133이 줄기세포의 특성을 가지고 있으며, 암세포의 세포분열을 촉진하는데 관여한다는 것을 의미한다.

그림 4. CD133의 세포분열 조절.
CD133의 세포분열과 관련된 기능을 규명하기 위하여 간암세포에 lentiviral system을 이용하여 CD133에 대한 shRNA를 주입하여 CD133의 발현을 억제하였다. 간암세포에서 shRNA로 CD133의 발현을 억제하였을 때 세포분열을 조절하는 단백질의 발현을 조절하여 세포주기에서 G0/G1 상태를 증가시켜 세포분열을 억제하였다 (A, B). Illumina microarray platform을 이용한 마이크로어레이 분석에서, 특히 CD133의 억제는 세포분열과정에서 중심체(centrosomes)의 위치(localization)와 동원체(kinetochore)에서 미세소관의 유동성(microtubule dynamics)을 조절하는데 관여하는 유전자의 발현이 억제되어 있었다 (C-E). 이러한 결과는 CD133이 세포분열을 조절하는 기능을 하고 있으며, CD133 발현의 증가는 세포분열을 증가시켜 암세포의 성장과 크기를 증가시키는데 관여하고 있다는 것을 의미한다.

그림 5. 마우스 xenograft 모델
STAT3 의존성 CD133 발현 증가에 의한 종양형성의 증가에 대한 기능을 in vivo 시스템을 통하여 규명하기 위하여 CD133 발현이 증가된 간암세포를 마우스에 주입하여 xenograft 모델을 만들었다. 종양이 형성된 이후 STAT3 억제제인 nifuroxazide 또는 sorafenib을 단독으로 투여하여 종양의 크기를 측정하였다. 대조군에서는 종양의 크기가 현저하게 증가하였다. 하지만 nifuroxazide 또는 sorafenib 투여하였을 경우 대조군과 비교하여 현저하게 종양의 크기가 감소하였다 (A). 종양조직에 대한 면역화학적 염색과 분자생물학적 접근에서도 nifuroxazide 또는 sorafenib을 투여하였을 때 활성화된 STAT3, 그리고 HIF-1 와 CD133 및 세포주기와 관련된 단백질의 발현이 현저하게 감소되어 있는 것을 확인하였다 (B, C). 암미세환경에서 STAT3와 HIF-1 에 의한 CD133 발현 증가에 의한 간암 유발 모식도 (D). 이러한 결과는 in vitro에서 IL-6에 의하여 활성화된 STAT3와 저산소상태에서 HIF-1 에 의하여 CD133의 발현이 유도되며, 증가된 CD133이 세포분열을 촉진시켜 종양의 형성과 성장에 중요한 역할을 하고 있다는 것을 뒷받침하는 결과이다. 따라서 암미세환경에서 STAT3의 활성과 HIF-1 를 표적으로 하는 방법이 새로운 간암을 치료할 수 있는 가능성을 제시한다.