1. 논문관련 분야의 소개, 동향, 전망을 설명, 연구과정에서 생긴 에피소드

프로테아좀(proteasome)은 유비키틴화(Ubiquitylation)된 기질단백질을 선택적으로 분해하는 거대한 효소복합체로, 세포내 단백질의 항상성유지에 중심적인 역할을 담당합니다(그림1). 최근에는, 프로테아좀기능의 결함이 신경변성질환등 다양한 난치성질환을 유발한다거나, 프로테아좀 저해제가 혈액암에 효과적인 사실도 여러 연구를 통해 증명되고 있어, 해당 기초연구는 분자기작의 규명 뿐 만이 아니라 임상연구에 있어서도 주목을 받고 있습니다. 프로테아좀은 약 66개의 subunit단백질에 의해 형성되는 것이 in vitro해석을 통해 잘 알려져 있으나, 프로테아좀이 실제로 live cell내에서 발현될 때 어디서 복합체로서 완성이 되는지, 완성된 복합체가 어느 정도 농도 및 어떤 상태로 존재하는지 등 세포내 프로테아좀의 기본적인 성질에 대해서는 전혀 알려진 바가 없었습니다.

본 연구에서는 형광단백질(GFP、mCherry)을 프로테아좀의 subunit에 결합시킨 효모세포주를 다양한 조합으로 제작한 후, 고감도의 형광상관분광법(fluorescence correlation spectroscopy)을 이용하여 live cell에서 직접 프로테아좀의 다양한 성질을 정량적으로 해석하였습니다(그림2). 그 결과①프로테아좀을 구성하는 대부분의 subunit단백질은 완성된 프로테아좀복합체(26S)로써 결합되어 있다는 사실과, ②완성된 프로테아좀복합체는 subunit가 이탈하는 일 없이 안정하게 존재하며, ③세포질내 프로테아좀의 반은 자유확산운동(Brownian diffusion)을 하는 반면 나머지 반은 세포내 소기관(미토콘드리아, 소포체, 골지체 등)과 상호작용하고 있을 가능성이 높다는 사실,④또한 핵내에서는 염색체 등 전사와 관련된 인자와 강하게 상호작용하고 있음이 처음으로 밝혀졌습니다. 그에 더하여, 세포내 프로테아좀의 절대농도는 세포질에서 약 200nM, 핵질에서 약 1 M였고. 흥미롭게도, 핵내로 프로테아좀이 운반되지 않는 유송담체/임포틴(Importin)의 변이형세포주의 세포질을 해석한 결과, 세포질에서 완성된 26S 프로테아좀은 그대로 핵까지 운반된다는 흥미로운 사실도 새롭게 밝혀졌습니다. 지금까지는 종래의 많은 in vitro연구를 통해 핵내에 존재하는 프로테아좀은 세포질의 subunit가 각각 핵내로 유송된 후 완성된다고 알려져 있었기 때문에(그림3), 앞으로는 이러한 거대분자가 어떻게 직접 핵막공을 통과하는지에 대한 연구도 활발해 질 것이라 봅니다.

▷．동향 및 전망

이번 연구에서는 완성된 26S프로테아좀 거대분자가 핵내에서 유전자의 전사에 물리적으로 항상 관여하고 있다는 것을 yeast live cell(endogenous condition)에서 직접 확인하였습니다. 이번 연구에 더하여 연구진은 이미 mouse 및 human에서 유래하는 특정 배양세포에서도 동일한 결과들을 확인하였습니다.

앞으로는 세포질에서는 어떤 타겟 소기관과 상호작용하는지, 핵막공을 통과하는 분자의 직접 이미징 가능여부, 세포질 및 핵내에 존재하는 프로테아좀의 농도밸런스는 어떻게 유지되고 있는지에 대한 해당 작용 메카니즘 등에 대한 규명이 중요하다고 생각합니다. 응용적 측면에서는, 현재26S 프로테아좀을 타겟으로 한 차세대 혈액암제(proteasome inhibitor)의 개발에 기여하기 위해, highly sensitive/quantitative live cell imaging을 기반으로 한 screening 기술개발이 중요하다고 생각하며, 따라서 임상 및 약학적 응용을 위한 맞춤형 중개연구로 발전시켜 나아갈 계획입니다.

＜부가설명＞
[1]Proteasome
세포질과 핵내부의 불필요한 단백질을 분해하는 약 2.5MDa(직경20nm, 길이45nm의 선형분자)의 거대한 효소복합체. 폴리유비키틴사에 의해 수식된 기질단백질을 선택적으로 분해함으로써 다양한 생명현상을 제어한다.

[2]Ubiquitylation
단백질의 번역후 수식에 사용되는 작은 단백질을 [ubiquitin/유비키틴]이라고 한다. 단백질 분해, DNA repair, 전사조절, 신호전달 등 광범위한 생명현상에 관련되어 있다. Ubiquitin에 의한 단백질의 번역후 수식-ubiquitylation에 관한 연구는 2004년 노벨상을 수여. 다수의 ubiquitin가 연결되어 생성되는 poly-ubiqutylation은 프로테아좀에 의한 분해신호로써 작용한다.

[3]Fluorescence correlation spectroscopy
공촛점광학계와 단일분자 수준의 고감도검출기를 이용해 공촛점관찰영역 안에서 발생하는 형광변동신호를 계측하는 정량적수법. Single-color(fluorescence auto-correlation spectroscopy)의 경우 용액 및 세포내 형광분자의 절대농도, 분자크기, 모양, 분자의 간접적인 상호작용 등을 측정할 수 있다. Dual-color(fluorescence cross-correlation spectroscopy)를 사용하면 2가지 특정분자의 상호작용을 직접 측정할 수 있다. 현재까지 개발된 여러형광수법에 비해, 용액내에서는 물론, 세포내 구석구석까지 나누어서 정량적으로 분자의 물리화학적 파라미터를 단일분자 수준에서 알아낼 수 있는 특징이 있다.

[4]Importin
세포질과 핵은 핵막으로 나누어져 있는데, 핵막에는 핵막공(nuclear pore, 효모의 경우 직경 약38nm)이 존재한다. 핵막공은 분자의 출입을 분자크기 별로 제어하고 있으며, 세포질에서 핵안으로 들어가려면 핵막공을 통과하기 위한 NLS(nuclear localization signal)라고 하는 특정한 아미노산배열의 신호가 필요하다. Importin/임포틴은 NLS에 결합하여 타겟분자를 세포질에서 세포핵안으로 운반하는 역할을 담당하는 유송단백질을 가르킴.

[5]Proteasome inhibitor
프로테아좀의 효소활성중심을 선택적으로 저해하는 화합물을 가르킴. Bortezomib(상표명Velcade®)과Carfilzomb（상표명Kyprolis®）은 혈액암의 일종인 다발성골수종의 치료약으로 사용되고 있고, 부작용이 적고 보다 선택적인 저해가 가능한 차세대 저해재의 개발이 주목받고 있다.

그림1. 26S프로테아좀의 모식도. 프로테아좀은 유비키틴화된 단백질을 분해하는 거대한 효소복합체. 세포내 단백질의 항상성유지를 위해 중심적인 역할을 담당합니다.

그림2. 두 종류의 형광상관법과 형광상관함수의 파라미터를 나타내는 모식도. 형광신호의 변동(temporal fluctuation)을 계산하여 얻어지는 형광상관함수(G( ))는 용액샘플 혹은 세포내 형광분자의 절대농도, 분자량, 분자모양, 특정분자간 상호작용(Kd)값을 포함합니다.

그림3. 형광상관함수를 이용한 효모세포내 프로테아좀의 해석예. (왼쪽)GFP로 수식된 프로테아좀을 발현(endogenous)하는 효모세포의 공촛점현광현미경상. C는 세포질, N은 핵내 포인트 FCS측정을 표시. (오른쪽)각 포인트 측정을 통해 얻어진 형광상관함수의 비선형fit해석을 통해 각 파라미터를 얻을 수 있습니다.

그림4. 본 연구를 통해 밝혀진 세포내 프로테아좀복합체의 특성. 1. 세포질에서 완성된 프로테아좀(26S)는 빠른 속도로 자유확산(6 m2/s미만)하면서 세포내 전체에 분포합니다. 2. 세포질내 소기관과 상화작용하면서 확산합니다(0.2 m2/s미만). 3.4. 26S사이즈로 핵막공을 통과 핵으로 이동. 5. 핵내 전사인자관련 타겟분자(DNA)와 항상 상호작용하고 있습니다.

▷．에피소드

생물학적 관점에서 세포내에는 많은 분자가 발현되어 조밀하게 분포하고 있기 때문에 대부분의 생체분자 혹은 입자는 세포내에서 dynamic하게 움직일 수 없을 것으로 생각되어져 왔습니다. 하지만, 최근 바이오이미징의 발전과 live cell계측을 계기로 단백질 등 많은 분자가 사실은 세포질 과 핵질은 물론 고밀도의 분열기 염색체내에서 조차 물리화학법칙(Stokes-Einstein relation)에 의해 자유확산(Brownian diffusion)하고 있음이 선행연구들과 본인의 연구를 통해 밝혀지고 있었습니다. 그런 와중에 사이즈가 비교적 큰 기능성분자(리보솜, 프로테아좀, HSP104 등)나 합성나노입자가 세포내에서 어떤 거동을 하는지에 대해서 단순한 물리화학적 관점에서 의문이 생겼고, 마침 일본에는 26S관련 연구의 세계적인 석학이신 Tanaka Keiji박사(동경도립임상종합연구소 소장)가 계셨기 때문에 Tanaka K.소장(Saeki Y.박사)에 부탁하여 무작정 live cell측정부터 시작하게 되었습니다. 다행이도 고감도의 형광상관법계측을 통해 자신의 의문이 해소되는 것은 물론, 부차적으로는 종래의 연구수법 만으로는 알 수 없었던 프로테아좀의 새로운 성질들이 밝혀지게 되었고, 그에 따라 본 연구가 구체화 되어 논문발표까지 연결되게 되었습니다.

2. 연구를 진행했던 소속기관 또는 연구소에 대해 소개 부탁 드립니다.

일본 이화학연구소는 물리, 화학 뿐만아니라 공학과 생물학, 의학, 산업화에 이르기까지 많은 분야의 연구를 활성화시키기 위해 구성된 국가소속의 독립행정기구로, 본인이 소속한 기초생물학관련 연구조직은 본소인 사이타마(Saitama)현 와코(Wako)시에 위치하고 있습니다. 사이타마현이기는 하지만, 실제로는 동경도 이케부쿠로(Ikebukuro)에서 전철을 이용하면 15분 거리로, 3월말경에 만개하는 시내공원 및 연구소내 벚꽃은 상당히 장관입니다. 참고로, 본인이 소속한 Cellular Informatics Lab.은 EGFR(ErbB)과 관련 인자의 신호전달 작용기작을 in vitro 및 live cell계측을 통해 이론통계학 및 실험생물물리학적인 관점에서 규명하기 위해 고감도의 정량적 형광이미징 수법들을 다양하게 구사하고 있습니다.

3. 연구활동 하시면서 평소 느끼신 점 또는 자부심, 보람

고감도의 형광상관분광법은 분자나 광화학 반응을 고감도로 검출하기 위해 개발된 수법이었지만, 물리화학 이외에도 생물물리를 비롯한 생명과학관련 연구와 연계되어 새롭고 학제적인 연구를 수행하는데 있어서 중요한 신기술이 될 것이라는 신념을 가지고, 박사학위과정부터 지금까지 정량형광이미징 및 형광상관분광법에 고집하여 왔는데, 물리화학적 해석을 기반으로 한 다양한 세포생물학적 연구가 실현되는 것과 함께 세포내 생체분자의 성질(기능)이 물리화학적 법칙과 연관하여 설명 가능할 것이라는 가설이 점점 밝혀지고 있어서 많은 보람을 느낍니다.

4. 이 분야로 진학하려는 후배들 또는 유학준비생들에게 도움이 되는 말씀을 해 주신다면?

생명과학연구에 있어서 in vitro해석이나 공촛점형광현미경을 통한 정적관찰을 주로 하는 종래의 방법과는 달리, 최근에는 새롭고 다양한 고감도/고정량 형광이미징계측 기술들이 발전하여 live cell에서만 발견 할 수 있는 새로운 기작도 발견되고 있습니다. 장기적인 안목에서 자신의 연구에 적합한 해석기술을 잘 선별하여 습득하고 학제적이고 새로운 관점에서 연구를 하면 큰 연구재산이 될 거라고 생각합니다.

5. 연구활동과 관련된 앞으로의 계획이 있으시다면?

앞으로도 지속적으로 형광상관분광법을 중심으로, 물리화학, 합성화학, 공학, 기초생물학, 의학 및 약학을 상호연계하는 중개적 연구를 개발하여 나아갈 생각입니다. 관심있으신 모든 분들의 연락을 언제든 환영합니다.

6. 다른 하시고 싶은 이야기들....

지금까지 이루어진 많은 학제적 연구가 전문이 다른 각 분야의 공동연구자분들이 이해해주시고 협력해 주셨기에 성공적으로 진행되었다고 생각합니다. 협력해 주신 모든 연구자분들께 감사의 말씀을 전하고 싶습니다.