1. 논문관련 분야의 소개, 동향, 전망을 설명, 연구과정에서 생긴 에피소드

단일세포 기반 연구는 지금까지 주로 하나의 molecular layer를 중심으로 발전해 왔습니다. 예를 들어 scRNA-seq은 특정 조절인자의 최종 결과물인 유전자 발현을 측정하고, scATAC-seq은 유전자가 발현될 수 있는 가능성을 보여주는 chromatin state를 측정합니다. 하지만 DNA motif나 open chromatin 정보만으로는 실제로 어떤 조절인자가 어느 위치에서, 어떤 방식으로 유전자 발현 조절에 관여하는지를 직접 확인하기 어렵다는 한계가 있습니다. 저희 연구진은 이러한 과정을 보다 정확하게 이해하기 위해, 전사인자를 포함해 기존 기술로는 포착하기 어려웠던 단백질:DNA 상호작용을 단일세포 수준에서 읽어낼 수 있는 방법을 개발하고자 이 연구를 시작했습니다.

유전자 발현 조절은 DNA를 인식하거나 chromatin 구조를 변화시키는 다양한 transcription factor와 chromatin remodeler의 상호작용을 통해 이루어집니다. 이러한 단백질:DNA 상호작용을 프로파일링하기 위해 여러 기술이 개발되어 왔으며, 대표적인 방법으로 Chromatin Immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq)이 있습니다. ChIP-seq은 ENCODE project를 비롯한 다양한 epigenomics 연구에서 histone modification 및 transcription factor의 DNA 상호작용을 규명하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 그러나 많은 양의 input sample이 필요하고, cross-linking 과정에서 target protein loss가 발생할 수 있으며, antibody off-target 등의 문제로 인해 signal-to-noise ratio가 낮아질 수 있다는 한계가 있었습니다.

이후 개발된 CUT&RUN과 CUT&Tag은 항체를 이용해 표적 단백질 주변에서 원하는 반응을 유도하는 방식으로 보다 높은 해상도의 신호를 감지할 수 있습니다. CUT&RUN은 nuclease를 이용해 표적 단백질 주변의 DNA를 절단하여 sequencing을 위한 fragments를 만들고, CUT&Tag은 Tn5 tagmentation을 통해 adapter sequence를 삽입한 뒤 시퀀싱하는 방법입니다. 이들은 ChIP-seq에 비해 더 높은 해상도와 낮은 background noise를 보이는 장점이 있으며, 특히 histone modification처럼 비교적 안정적인 chromatin mark에는 효과적으로 적용될 수 있습니다. 그러나 일반적으로 high salt 조건에서 실험이 진행되기 때문에, transcription factor:DNA interaction처럼 약하거나 일시적인 상호작용은 실험 과정에서 소실될 가능성이 있으며 single-cell sequencing platform에 바로 적용이 어렵다는 한계가 있습니다.

저희 연구진은 이러한 한계를 보완하기 위해 senior author인 Dr. Ivan Raimondi가 앞서 개발한 Nanobody-Tethered Transposition followed by sequencing (NTT-seq)의 nanobody-tethering system을 응용한 새로운 접근법을 설계했습니다. 이 방법은 DNA와 약하거나 일시적으로 상호작용하는 단백질 주변에서 deamination을 유도하고, 그 결과 생성되는 C→U base edit을 시퀀싱을 통해 읽어내는 방식입니다. 특히 약한 단백질:DNA 상호작용을 보존하기 위해 low salt condition에서 최적화되었으며, 여러 transcription factor뿐만 아니라 DNA motif를 직접 인식하지 않는 chromatin remodeler에도 성공적으로 적용할 수 있었습니다.

또한 D&D-seq은 특정 readout 방식에 제한되지 않는다는 장점이 있습니다. ATAC-seq 기반 readout뿐만 아니라 RNA와 ATAC profile을 동시에 측정할 수 있는 Multiome에도 적용할 수 있었으며, 저희 연구실에서 주로 사용하는 Primary Template Amplification (PTA) 방식의 Whole-Genome Sequencing에 적용이 가능했으며, 이를 통하여 open chromatin뿐만 아니라 closed chromatin 영역에서 일어나는 단백질:DNA 상호작용까지 분석할 수 있었습니다. 이를 통해 단일세포 수준에서 유전자 발현, chromatin accessibility, 그리고 실제 단백질:DNA interaction을 보다 직접적으로 연결해 해석할 수 있는 기반을 마련했습니다.

2. 연구를 진행했던 소속기관 또는 연구소에 대해 소개 부탁드립니다.

제가 속한 Landau lab은 New York City의 Upper East Side에 위치한 Weill Cornell Medicine (WCM)과 SoHo에 위치한 New York Genome Center (NYGC) 두 곳에서 연구실을 운영하고 있습니다. WCM 연구실은 주로 wet lab 구성원들을 위한 실험 시설과 장비를 갖추고 있으며, NYGC에는 비교적 넓은 사무공간 마련되어 있어 저는 대부분의 시간을 NYGC에서 보내고 있습니다. NYGC는 WCM, Columbia University, New York University, Cold Spring Harbor 등 뉴욕 내 여러 대학과 연구기관에 소속된 연구진들이 함께 모여 있는 곳입니다. Epigenetics 분야의 선구자인 Bing Ren 교수님, single-cell 분석 기술의 기반을 다진 Rahul Satija 교수님을 비롯해 다양한 분야를 이끄는 연구자들이 함께하고 있어, 매우 활발하고 역동적인 연구환경이 조성되어 있습니다. 또한 다양한 학술 이벤트와 세미나가 자주 열리기 때문에, 다른 연구실 소속의 학생이나 포스닥들과 자연스럽게 교류할 기회가 많습니다. 이러한 환경에서 다른 관점을 가진 동료로부터 새로운 아이디어를 얻고, 이를 기반으로 한 공동연구를 시작할 수 있는 좋은 기반이 된다는 점에서 큰 장점이라고 생각합니다.

3. 연구 활동 하시면서 평소 느끼신 점 또는 자부심, 보람

이번 연구를 진행하면서 여러 분야의 교수님들, 포스닥들과 이야기를 나눌 수 있었습니다. 특히 저희 논문 draft를 bioRxiv에 게재한 뒤 많은 연락을 받았는데, 저희가 진행한 연구가 많은 관심을 받고 있다는 점에서 큰 보람을 느꼈습니다. 동시에 이전에는 아무도 보지 못했던 결과를 처음으로 다루고 있다는 사실이 매우 새롭게 다가왔습니다. 초기에는 Wei-Yu와 첫 파일럿 데이터를 기다리며 어떤 형태로 D&D-seq signal이 나타날지 여러 가지 상상을 했는데, 실제 데이터로 저희가 예상했던 형태의 deamination 분포가 나타나는 것을 보고 무척 신기했고, 연구가 올바른 방향으로 진행되고 있다는 확신과 많은 동기부여를 얻을 수 있었습니다. 최근에는 후속 연구를 계획하고 fellowship을 준비하는 과정에서 많은 분들께 도움을 받게 되었는데, 여러 연구실들이 저희 연구에 많은 관심을 가져주고 다양한 조언을 주신 점에 깊이 감사하고 있습니다. 특히 대학원 생활때부터 논문으로만 접해 오던 연구실들과 D&D-seq을 기반으로 한 공동연구를 시작하게 된 것은 개인적으로도 매우 뜻깊은 일로 생각합니다.

4. 이 분야로 진학하려는 후배들 또는 유학준비생들에게 도움이 되는 말씀을 해 주신다면?

현재의 단일세포 데이터 분석은 주로 특정 regulatory network의 결과값인 RNA 발현이나, 이를 조절할 수 있는 regulatory circuit의 가능성을 보여주는 ATAC-seq처럼 하나의 modality를 읽어내는 방식에 집중되어 있습니다. 그러나 유전자 발현 조절은 여러가지 molecular layer가 함께 작동하는 과정이기 때문에, 서로 다른 layers를 직접 연결하는 multi-omics 수준에서는 아직 많은 부분이 누락되어 있습니다. 최근 FDA 승인을 받은 Menin inhibitor와 같이 epigenetic regulator들을 타겟으로 한 치료제 개발 연구가 활발히 진행되는 만큼, 이러한 regulator들이 어떤 regulatory networks를 통해 세포상태를 조절하는지 정확히 이해하는 것이 매우 중요하다고 생각합니다. 이를 보다 정밀하게 이해할 수 있다면, 보다 효과적인 방법으로 종양 억제 및 치료제 개발이 가능할 것으로 보입니다. 또한 machine learning과 deep learning 접근이 보다 쉬워진 만큼, 이를 활용한 단일세포 및 epigenomics 데이터 분석이 점점 더 보편화 되고 있습니다 (scPrinter, ChromBPNet). 앞으로 transcriptional regulation 및 그 output을 예측 모델들이 보다 높은 성능으로 더욱 많이 등장할 것으로 보이며, 이러한 발전이 궁극적으로 virtual cell model 연구에도 중요한 진전을 가져올 것으로 예상합니다.

5. 연구 활동과 관련된 앞으로의 계획이 있으시다면?

후속 연구에서는 단일세포 수준의 분화 과정에서 chromatin remodeler의 DNA 상호작용 변화, 특히 mammalian SWI/SNF complex의 DNA interaction 상태와 종양과 관련된 돌연변이가 생겼을 때 나타나는 mSWI/SNF complex의 DNA interaction 변화와 재분배 및 이로 인해 나타나는 chromatin 및 transcriptome output 변화를 파악하고자 합니다. 특히 chromatin remodeler의 경우 약한 결합을 보이는 특징으로 ChIP-seq이나 CUT&RUN과 같은 reference 데이터가 동일한 실험 조건으로 존재하지 않으므로, D&D-seq을 활용한 DNA-protein interaction을 분석하기 위한 예측 모델을 개발하여 검증하고, 이들의 DNA 상호작용과 관련된 DNA sequence syntax 를 파악하고자 합니다.

6. 다른 하시고 싶은 이야기들.....

지난 2년간 위 연구를 진행하면서 많은 도움을 준 지도교수님 Dan과 연구실 모든 구성원들께 감사의 말씀을 드립니다. 공동 저자인 Wei-Yu와 senior author인 Ivan이 많은 영감을 주었으며, 매주 만나며 나눈 크고 작은 피드백이 모여 좋은 결과로 만들어질 수 있었던 것 같습니다. 연구실 초기 새로운 데이터 타입을 분석하며 많은 시행착오를 겪었는데, 힘들 때마다 항상 자기일처럼 도움을 준 Tamara와 Drew에게 항상 감사하고 있습니다. 지난 2년간 제가 집에 돌아오는 시간만 기다리며 제 곁에 꼭 붙어있는 강아지 Oz도 항상 건강하고 오래오래 행복하게 함께 해주길 바랍니다.