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Q DNA smear 현상? 원인

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레벨02 4족보행 (일반인)

  • 25.01.07 14:49
  • 조회679
안녕하세요.

동물 DNA 추출 후 PCR 산물로 전기영동을 내렸는데 밴드가 제대로 뜨지 않아 문의 남깁니다.
계속 밴드가 잘 나왔었고 이렇게 끌림 현상이 있는 경우는 처음이라서 원인을 잘 모르겠습니다.
조건) PCR  annealing-49.5℃
         PCR  volume-total 20ul(DNA 1ul)
         TAE buffer 농도-1.4%
         전압-130v / 20분 내림
         gel은 보통 20분 정도 굳힘

그리고 사진이 smear현상이 맞나요?!


DNA smear 현상? 원인

Laboratory Animals > etc.

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답변등록

A 답변 8

  • 레벨05 REPLA (과기인)
  • 25.01.07 15:04
PCR product 사이즈가 500-600 bp 정도 되나요?
젤에 로딩한 샘플 (DNA 농도)이 너무 높은 것 같습니다. 
적당히 희석해서 로딩해보시면 좋을 것 같습니다. 
Template로 사용하는 gDNA 농도도 1-5 ng 정도면 충분하고, primer 농도는 0.5 μM로 사용하셔요. 

젤은 충분히 녹은 상태에서 잘 혼합해준 다음 만드시고, 0.9-1% agarose gel 사용하시면 10 kb 까지 분리 가능합니다. 
전압은 100 V에서 30분 정도 내려가는 것 보고 충분히 분리해주시고요. TAE buffer도 오염된 것 같으면 새 걸로 갈아서 사용하세요~


  • 레벨02 4족보행 (일반인)
  • 25.01.07 15:29
  • 질문자
감사합니다!  

답변에서 DNA 농도가 높다고 하셨는데 이해가 안되서요.
(nano drop 결과 Concentration: 3.532ug/ml 값이 나왔는데
계속해서 해오던 전기영동에서도 똑같은 nano drop 값, 조건으로 실험 시 끌림 현상은 없었습니다.)

참고로 다른 사람이 같은 샘플로 PCR 산물을 만들어 전기영동을 내렸는데(조건 모두 동일) 일부는 선명하게 나왔고 일부는 끌림현상이
있었습니다.
  • 레벨08 SPEED (일반인) heart
  • 25.01.07 15:45
smear로 보이는 것은 전기영동 문제이며 조금더 내리고 %를 올리는 것이 좋습니다.

marker도 낮은 분자량은 smear하게 보입니다.

그리고 PCR mixture에서 primer양을 줄이세요.
  • 레벨02 4족보행 (일반인)
  • 25.01.07 15:58
  • 질문자
감사합니다.

답변에서 primer양을 줄이라고 하셨는데 지금 F/R 각각 1ul씩 넣고 있는데 여기서 더 줄여야 하나요??
참고로 마이크로 피펫으로 분주 시 조금씩 loss가 나는데 이런 부분은 상관 없을까요?
(멸균된 tip을 사용하고 있는데 어떻게 해도 조금씩 남아있습니다)

그리고 왜 primer양을 줄어야 하는지 설명 부탁드리겠습니다.


  • 레벨08 SPEED (일반인) heart
  • 25.01.07 16:33
반응에 사용되지 않고 남은 primer가 상당히 많습니다.

따라서 현재양에서 반으로 줄여도 됩니다.

2배 희석해서 1ul 사용하면 됩니다.
  • 레벨05 depth (과기인)
  • 25.01.07 16:20
primer의 양을 줄여야 하는 이유는 가장 밑에 두꺼운 밴드가 primer dimer이기 때문입니다.
반응에 사용되지 않은 primer들이 저렇게 보여지는거죠. 
실험자가 원하는건 타겟 사이즈의 밴드 하나인데 불필요한 primer dimer가 생성되는 건 최적의 PCR 조건이 아니라는 뜻 입니다.
다른 분들께서 사용하는 primer의 양을 줄이라고 조언주시는 이유가 위와 같습니다.
그리고 추가적인 질문이 있다면 다른 표현으로 선생님들께 여쭤보시면 더욱 자세한 답변을 들을 수 있을 거에요ㅎㅎ  
그럼 실험 수고하세요!!
  • 레벨02 Q.E.D. (일반인)
  • 25.01.07 17:39
위에분들이 답변을 너무 잘 해주셨는데
혹시라도 이해를 못 할까봐 
대충 남깁니다

DNA smear 현상? 원인

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