THP-1-differentiated-macrophages (PMA & LPS) 에서 IL-1b 발현 여부 | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q THP-1-differentiated-macrophages (PMA & LPS) 에서 IL-1b 발현 여부

레벨01 까악까악까치 (대학원생)

25.01.06 11:46
조회236

안녕하세요.

저는 PMA와 LPS를 이용하여 THP-1-differentiated-macrophages 사용하여 실험을 진행하고 있습니다.

제가 다른 논문을 참고 하였을 때

THP-1에 PMA와 LPS를 처리했을 때 LPS까지 처리한 군에서

Proinflammatory cytokines인 IL-1b, TNF-a, IL-6 등이 발현이 잘 되는 것으로 알려져 있는데

제가 여러 primer을 짠 후 실험해본 결과

PMA군 보다 LPS군이 더 낮게 IL-1b가 발현하였습니다.

하지만 IL-1b를 제외 하고는 TNF-a와 IL-6들은 잘 발현이 됩니다.

이러한 경우 어떤 문제 때문에 IL-1b가 발현이 잘 되지 않는 건지 궁금합니다.

저는 현재 하단에 그림으로 표시 된 lps를 사용하고 있습니다.

아시는 분들은 꼭 답변을 남겨주시면 감사드리겠습니다.

Immunology > etc.

등록순
추천순

A 답변 8

레벨08 SPEED (일반인) heart
25.01.06 12:13

어떤 방법으로 측정 했나요?

답변리플

레벨01 까악까악까치 (대학원생)
25.01.06 12:19
질문자

mRNA 수준에서 확인 했습니다 ! RT-qPCR이요

레벨08 SPEED (일반인) heart
25.01.06 13:39

IL-6가 잘 나오면 LPS signal에는 문제가 없습니다.

몇번 반복해서 확인했나요?

레벨01 까악까악까치 (대학원생)
25.01.06 15:56
질문자

수도 없이 다른 프라이머들로 확인을 했습니다 ..

안 나올리가 없는데 .. 제가 프라이머를 잘못 짠 건가 싶기도 하고 ..
하지만 논문에서 나온 프라이머도 사용하여 실험을 진행 하였는데도 발현을 하지 않았습니다 ..

레벨08 SPEED (일반인) heart
25.01.06 16:46

IL-6, IL-1b는 같은 pathway이기 때문에 LPS로 동일하게 영향을 받습니다.

실험에서의 문제점을 찾아보는것이 필요할듯 합니다.

레벨02 Q.E.D. (일반인)
25.01.06 22:16

제 경험상 두 번 정도

LPS 상태가 이상해 져서

세포가 반응을 하지 않았던 경우가 있었습니다.

이때 여러 랩을 돌아다니며 LPS를 얻어

써보고 재주문을 하기도 했었고

세포를 다시 풀어서 결과를 낸 적은 있으나

이 경우는 그 문제는 아닌것 같고

꼭 Primer를 다시 확인해 보기를 권합니다.

본인이 짠것은 물론,

논문에 나온 primer라 하더라도 안 나올 수 있습니다.

정말 가장 대표적인 primer를 찾아서

온도별로 한 번 다시 한 번 해 보세요.

추가로 물론 세포 실험에서

mRNA 수준에서도 보지만

더 정확하게는 만들어진 최종 산물의 반응을 보기에

mRNA 데이터만 보지 않습니다.

이런 경우는 정 않 될 경우

추가로 cytokine ELISA는 해서 데이터를

한 번 더 검증 해 줘야 합니다.

그리고 IL-1beta의 경우 다른 사이토카인들보다

반응이 조금 늦게 나옵니다.

대략 24hr 후 반응 산물로 ELISA를 하기에

그런 부분도 고려는 해야 합니다.

그럼, 좋은 결과 얻어요.

답변리플

레벨06 bio (과기인)
25.01.06 23:38

저도 오래전 같은 문제로 고생했었는데

LPS중 E Coli보다는 Salmonella LPS가 더 반응이 좋았습니다.

한번 LPS를 바꿔서 실험해 보세요

지금 이전 데이터 찾아 보니 IL-1b, TNF-a, IL-6 발현이 Salmonella LPS 확실히 좋네요

답변리플

레벨01 영파니 (과기인)
25.01.10 09:16

혹시, 처리 시간이 어느정도 인가요?

THP-1에 PMA 처리로 macrophage 분화 후 LPS로 M1 proinflammatory cytokine 유도를 했던 경험이 있습니다.

제 경험상 어떤 LPS를 사용하는지, 어느 정도의 양을 처리하는지에 따라 M1 cytokine 발현 정도에 차이는 있었지만,

비교적 안정적으로 발현이 유지되는 단백질보다,

mRNA level에서 측정할 때 가장 큰 차이를 보이는 이유는 '처리 시간'이였습니다.

TNF, IL1B, IL6 모두 time dependent로 확인했을 때, 비교적 단시간인 3, 6시간 쯤에 mRNA 발현이 피크를 찍었고,

24시간에도 control에 비해 증가는 했지만 단시간 처리에 비해 매우 감소해 있었습니다.

ELISA를 통해 단백질 level로 보신다면 24시간 처리를 하셔도 될 듯 하지만,

qRT-PCR로 보신다면 처리 시간을 줄여보시는 것도 좋을 듯 합니다.

답변리플

실험Q&A를 통해 여러분의 지식을 나누어 주세요. 답변을 등록하시려면 로그인 해주세요.

본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

답변등록

Bio마켓 프리미엄

philekorea

필코리아테크놀로지 자주 쓰이는 Western Blot용 항체 50% 할인 -> 균일가 225,000원

할인행사D-14
eppendorf promotion

에펜도르프코리아 [에펜도르프]배양 가속화 – 신제품 CellXpert® CS220 CO2 Incubator Shaker

할인행사D-129
philekorea

필코리아테크놀로지 Western blots 이미지 검출을 위한 최고의 선택!

시약 기타

답변리플 등록하기

작성자

(일반인)

파일첨부

파일선택

신고하기

댓글 작성 로그인

스팸삭제