- strainer 사용 전에 효소액을 충분히 희석하여 활성을 중지시키셨나요?

- 마지막 과정 이전에는 세포를 풀어줄 때 잘 풀어졌나요?

1. 효소액을 40um strainer에 풀때는 collagenase가 안 섞인 평범한 1× HBSS로 2배이상 희석시켜주었습니다.

2. 7번 스텝을 진행할 때부터 이미 흐물흐물한 덩어리가 있어서 피펫이 잘 먹지 않았던 것 같습니다. 피펫팅도 세포가 죽을까봐 몇번만 했습니다.

효소 반응으로 인한 결과인 것으로 예상됩니다.

참고하셨다던 thermofisher 프로토콜과 다르게 하신 이유가 있는건가요?

뭉친 세포를 기계적으로 잘 풀어주면 괜찮을 것 같긴한데 직접 해보는 것이 아니라 확실하진 않네요. 

효소 반응 없이 기계적 분쇄와 RBC lysis만 수행하는 방법을 해보시는 것도 한 방법이겠네요.

여러 비장을 해야할 걸 감안하다보니 페트리디쉬에 collagenase hbss 용액을 담기는 번거로움이 많다 생각해서 thermofisher에서 제시하는 방법을 조금 변형하였습니다.

EDTA를 사용하지 않은 점과 rbc lysis 방법은 저희 연구실 선생님의 방식을 차용한 것이구요.

효소 반응 없이 하라는 말씀은 collagenase를 쓰지 않고 cell isolation을 해보라는 뜻일까요?

일단 저희도 collagenase 를 쓰지는 않았기에 방법 자체가 차이가 있는 듯 합니다. 제가 몇가지 궁금한 점과 조심스럽게 제안 드리는 내용은

1) 링집게를 통해 비장 적출 후 찌꺼기 같은 부분들은 모두 제거하고 이후 가위로 2-3조각 내고 그다음에 피스톤으로 으깨 주는 방법을 사용하는 것은 어떠하실지요?

온전한 비장을 바로 으깨는 것에 비해 조각을 내고나서 으깨는 것이 상대적으로 더 수득률을 높일 수 있는 방법입니다. 또한 strainer 뒷면에도 용액을 흘려주어 strainer 뒷면에 붙어 있던 세포도 사용하면 수득률을 더욱 높일 수 있습니다.

2) rbc lysis를 Dw로 하고 계신건지요?

Dw를 통해 1X 로 희석한 rbc lysis buffer가 아니라? 

3) 마지막으로, 배지에 녹아있는 cell counting 했을 때 cell은 모두 살아있었나요? (밝게 빛 났나요?)