pET 21a 벡터 크기 | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q pET 21a 벡터 크기

레벨01 Faker1 (대학생)

24.07.25 11:37
조회1506

pET 21a 뽑기 위해 키우고 prep 하고 나서 gel 내리면 5.5kb 정도에서 떠야 하는데 뜨지 않는 이유는 뭘까요? 7~10kb에서 vector가 뜹니다..

Prep 과정에 문제가 있나 싶었는데 Insert를 위해 plasmid 뽑은 경우에는 prep후 size 맞게 떴습니다..

E.coli Dh5a 키워서 하는건데 여기서 prep 하고 나서 10kb 전후로 나올만한게 있나요?

#Prep
#DNA

Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning

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A 답변 16

레벨02 제육 (대학생)
24.07.25 11:59

이런 경우는 사진이 있으면 답변을 받기 쉬울겁니다.

단순 plasmid prep을 한 후 gel 상에서 확인하면 muti band가 뜨고, 알려진 bp랑 다를 수 있습니다.

한 번 gel 사진을 확인해보세요.

Prep 과정에 문제가 있나 싶었는데 Insert를 위해 plasmid 뽑은 경우에는 prep후 size 맞게 떴습니다..

이건 무슨 말씀이신지 정확히 모르겠네요. insert가 들어간 plasmid를 뽑았다는 말씀이신가요. 아니면 insert를 넣기 위해 vector를 잘랐다는 말씀이신가요?

답변리플

레벨01 Faker1 (대학생)
24.07.25 12:09
질문자

insert도 plasmid 컷해서 만들어야하는데, 이 경우 plasmid prep은 잘 되었다는 것을 의미했습니다.

단순 plasmid prep 하고 multi band가 아닌 하나의 band만 뜨는데, 이 경우는 prep이 잘못된건가요?

알려진 bp랑 달라도 너무 다르고, 예전에 뽑았던 경우의 gel 사진이랑 이번에 뽑아서 내린 사진이랑 너무 다릅니다.

레벨02 제육 (대학생)
24.07.25 12:18

보통은 3개정도의 band가 뜨는게 정상이긴 하나 single band가 뜬다고 못쓰고 그런 것은 아닙니다.

말씀하신걸로는 insert가 이미 다른 plasmid 에 있어서 이걸 분리한다는 것처럼 보입니다.

그냥 단순 mini-prep했을 때 size가 어떤 건 맞고 어떤 건 아니라는 말씀이신가요?

레벨01 Faker1 (대학생)
24.07.25 12:21
질문자

네 클로닝을 위해서 vector와 insert 모두 plasmid cut해서 사용해야 하는데, vector plasmid의 경우 prep 후 gel 내렸을 때 band가 알맞은 위치에 뜨지 않습니다.

Insert plasmid는 그에 반해 사이즈 맞게 잘 떴고요.

레벨02 제육 (대학생)
24.07.25 12:39 (수정)

insert가 있는 plasmid 는 insert 얻으면 끝이니 그냥 cut해도 상관없을 것 같은데, insert를 넣을 backbone vector의 경우에는 insert를 넣기 전 사용하는 enzyme 등으로 cut 해서 vector map이랑 bp size을 비교해보고 사용하는 게 좋을 것 같네요.

-> band가 완전히 안 보이면 그냥 다시 뽑는 게 좋을 것 같네요.

레벨01 Faker1 (대학생)
24.07.25 12:55
질문자

지금 계속 다시 뽑고 있긴 한데, 뽑아서 enzyme 처리 하고 나서 gel 내리면 아무것도 없습니다.. 그래서 prep하고 바로 내려보고 있는건데, 계속해서 똑같이 안보여서..

그냥 보일때까지 뽑아볼까요?..

레벨02 제육 (대학생)
24.07.25 13:02

Band가 안보일 정도의 농도면 이후 실험을 하는데 제한사항이 많습니다.

그냥 몇 번 더 진행해보시고, 안 나오면 완전 처음부터 다시 하는게 좋겠네요.

레벨01 Faker1 (대학생)
24.07.25 14:40
질문자

혹시 prep시 elute 횟수가 band에 영향을 줄까요?

레벨02 제육 (대학생)
24.07.25 15:13

elution 횟수가 plasmid yield를 증가시킬 수 있는 방법 중 하나로 사용되나, 좀 더 진한 정도이지 안 나오던 band가 나오고 이 정도의 큰 변화 아닙니다. 그래도 혹시 모르니 다음에 하실 때는 total elution volume을 줄여서 농도를 높이거나, 나눠서 내리고 elution buffer를 dry oven 등에 넣고 따듯한 상태에서 진행하면 yield가 더 올라가긴 합니다. 그래도 band가 없으면 그냥 처음부터 다시 진행하는게 오히려 더 빠를 수 있어요.

레벨08 SPEED (일반인) heart
24.07.25 12:13

우선 1cut, 2cut해서 map과 비교해 보세요.

현재로서는 정답을 못찾습니다.