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Q cleaved caspase 3 western blot 결과

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레벨02 ddddd (과기인)

  • 24.07.15 17:22
  • 조회1530

cleaved caspase 3 western blot의 결과를 확인하던 중, 15 kDa에서 밴드가 계속 뜨는게 확인됩니다.

사용하고 있는 antibody는 cell signaling #9661을 사용하고 있는데요, sheet상에서는 19, 17 kDa만 잡는다고 하는데, 실험 결과에서는 cleaved form이 잡히는 조건에서만 19, 17, 15 kDa에서 잡힙니다.

혹시 같은 antibody를 사용하는데 저와 같은 결과를 얻으신 분이 있으신가요?

다른 회사의 antibody등을 찾아보니 3개의 band가 뜨는 antibody가 있더라구요 (ab214430에서 확인하였습니다.), 그리고 실험실에 caspase 3 antibody (cell signaling #9662, pro-active form 모두 확인 가능)로 동일한 샘플을 loading하여 확인하였을 때에도 cleaved form이 잡히는 곳에 동일하게 3밴드를 확인했습니다. 그렇다는 건 caspase 3가 cleaved 될때의 결과 산물인 것으로 생각이 되는데, 15 kDa즈음의 band의 정체는 무엇인지 궁금합니다. 

참고하여 공부할만한 reference를 가지고 계신 분이 계시다면, 혹은 저와 같은 antibody를 사용하고 있으면서 저와 동일한 결과를 얻으신 분이 있다면 알려주시면 감사하겠습니다.



Mol. Biol.-Protein > Western Blot

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답변등록

A 답변 11

  • 레벨08 SPEED (일반인) heart
  • 24.07.15 19:00

혹시 21, 19, 17아닌가요?


현재 사용하는 ab는 생산 할때 caspase 3의 large fragment 만 항원으로 사용해서 small fragment 는 ab로 생산될수가 없습니다.

  • 레벨02 ddddd (과기인)
  • 24.07.16 11:45
  • 질문자

관련 결과 그림을 첨부합니다. 21, 19, 17 kDa의 사이즈일까요?

band의 size evaluation을 해봤을 때, 맨 위의 밴드가 19 kDa, 두번째가 17 kDa, 3번째가 15 kDa으로 나옵니다.


cleaved caspase 3 western blot 결과
  • 레벨08 SPEED (일반인) heart
  • 24.07.16 12:32

제일 밑의 마커 분자량이 어떻게 되나요?

  • 레벨02 ddddd (과기인)
  • 24.07.16 13:58
  • 질문자

biorad marker를 사용하며 마지막 marker는 15 kDa입니다

  • 레벨08 SPEED (일반인) heart
  • 24.07.16 14:06

WB의 결과에서 보이는 cleaved caspase 3의 제일 밑의 band는 large fragment의 17kda입니다.

  • 레벨02 ddddd (과기인)
  • 24.07.16 15:54
  • 질문자

첨부파일 한번만 확인해주시면 감사하겠습니다..! 같은 샘플에 13% gel을 사용한 것이고 마찬가지로 가장 아래 마커 사이즈는 15 kDa입니다. 

저는 이 결과에서도 마찬가지로 3개의 밴드를 확인했습니다.

만약 가장 아래 밴드가 17 kDa라면 첨부파일의 결과처럼 보이지 않을 것 같다 생각이들어서요.. 혹시 어떤 이유에서 17 kDa인지 알 수 있을까요?

cleaved caspase 3 western blot 결과
  • 레벨08 SPEED (일반인) heart
  • 24.07.16 16:13 (수정)

두번째 사진의 마커 위치가 잘못된거 아닌가요?


transfer후에 마커 위치를 찍어놓은 사진은 없나요?


항상 reconfirm을 위해 scale bar를 옆에두고 사진으로 모든 결과를 남겨 놓는것이 좋습니다.


cleaved caspase 3의 ab를 만들때 small fragment 의 ag는 사용하지 않았기 때문에 small fragment 는 detection될 수가 없습니다.


또한 cleaved caspase 3의 small fragment 분자량은 15kda가 아니라 12~13kda입니다.

  • 레벨02 ddddd (과기인)
  • 24.07.16 17:17
  • 질문자

필름에 마커 표시를 한 후 바로 버리기 때문에 membrane의 사진을 가지고 있진 않습니다. 앞으로는 같이 확인해보겠습니다.

저도 맨 아래의 밴드가 small subunit이라고 생각되진 않지만, 계속 같은 위치에서 관찰이 되다 보니 궁금하여 찾아보는데 원하는 정보를 찾을 수 없어서 질문드렸습니다..!

같이 확인해주셔서 감사합니다!

  • 레벨08 SPEED (일반인) heart
  • 24.07.16 17:21

1. 원본은 필름이 아니라 멤브레인이기 때문에 필요하든 하지않든 사진으로 남겨 두는것이 좋습니다.


2. 항상 같은 위치에 나오지는 않는것 같습니다.

첨부 사진 2개를 봐도 차이가 나기 때문입니다.

  • 레벨02 ddddd (과기인)
  • 24.07.16 17:34
  • 질문자

그럼 마지막으로 한가지만 더 질문드리면, 3개의 밴드가 21, 19, 17 kDa이라 했을 때, 

19 kDa는 cleaved, 17 kDa은 prodomain까지 제거된 active form이라면 21 kDa은 어떤 상태인가요?

  • 채택된 답변입니다.
  • 레벨08 SPEED (일반인) heart
  • 24.07.16 18:32

caspase 3 zymogen 32kDa

active intermediate large 21, 19kDa

active large 17kDa

active small 12~13kDa


시료에 따라서 21kDa는 안나올수도 있습니다.

abcam ab에는 21kDa가 나와있습니다.

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