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subcloning insert가 계속 중간에서 잘려서 들어가는데 왜그런건지 아시는 분 있으실까요

레벨1 인생아 (대학원생)

등록일 2023.06.10 15:18:46
조회733

2kb insert를 5kb vector에 넣고 있습니다. 이전에 동일 벡터에 insert 1kb짜리로 넣을 때는 문제가 없었는데 이번에는 colony PCR까지는 밴드가 맞게 뜨는데 RE screening만 하면 5kb와 2kb가 아니라 1kb가 뜹니다...

insert는 mCherry-interest gene 이렇게 된 구조여서 자꾸 잘리는건가 싶기도 하고요.. 해결 방법이 있을 까요?

cut은 Xba1 & EcoR1으로 2 cut 하고 있고 insert 끝에 RE site를 붙인 primer로 PCR후 cut 해서 사용 / vector는 RE 자르고 gel extraction 해서 사용하고 있습니다.

실험 하면서 이상했던 점은 insert와 vector 모두 RE site는 하나씩 있는데 이상한 점은 gel extraction할 때 원하는 kb에서 밴드가 깔끔하게 잘리지는 않고 2밴드가 뜬다는 점(5kb(잘린 벡터 크기), 6kb (원래 vector 크기)) 입니다. 처음할때는 그냥 안잘린 밴드인 줄 알았는데 2번 반복해도 동일하게 밴드가 뜨네요

그런데 또 RE screening해보면 insert부분의 크기가 반 잘려서 그렇지 vector 크기는 맞게 나옵니다... 혹시 뭐가 문제인지 아시는 분 있으신가요?

#subcloning
#RE screening

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답변 3

답변등록

레벨8 SPEED
2023.06.10 16:21

vector only, vector+insert 안자른 전기영동 사진 있나요?

vector를 잘랐을 때 2band가 나오는 것은 안잘리고 남은 것이 있어서 그렇습니다.

레벨1 인생아 (대학원생)
2023.06.10 20:35

uncut은 따로 사진이 없습니다..! 내려보면 문제가 뭔지 알 수 있을까요..?

레벨8 SPEED
2023.06.11 09:12

- 1kb가 들어갔는지 2kb가 들어갔는지 어느정도 파악이 됩니다.

- 여러번 했는데 1kb만 계속 나온다면 염기서열 분석을 해 보세요.

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