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웨스턴 Western Blot 실험 관련 질문드립니다.

레벨1 2두현 (과기인)

등록일 2023.06.09 16:16:25
조회911

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1. 같은 양(20ul)으로 로딩했지만 사진처럼 well에서 일정하게 보이지 않고, 다 다른 양으로 보이는데 이유가 뭘까요..? 나중에 문제가 되지 않나요?

* 전립선 조직으로 단백질 양 40ug.

2. Caspase 3 1차 AB 1:1000 (abcam사용)으로 희석하여 Overnight 후 2차 AB 1:5000으로 1시간 붙인 후 찍은 사진입니다. well끼리 다 손을 잡고 있는데,. 이유가 뭘까요?

웨스턴 고수님들 답변 부탁드립니다. 감사합니다.

#Western Blot
#Caspase 3

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레벨3 쿵쿠따리쿵쿠따
2023.06.09 18:02

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질문자가 채택한 답변입니다.

제가 아는 선에서 답변 드리겠습니다!

1. 웰 마다 같은 양을 로딩 하셨다고 하셨는데, 혹시 로딩 하실 때 너무 빨리 로딩하시지는 않으셨나요? 파이펫으로 로딩할 때 웰에 너무 빨리 넣어버리면 샘플이 웰에 빨리 차거나 혹은 바깥으로 다 나가게 됩니다! 이 부분 체크 해 보시면 좋을 거 같아요

2. 2번은 제일 아래 진한 검정 부분이 일자로 쭉 연결 된 걸 말씀하시는 걸까요? 혹시 해당 안티바디 사이즈 체크 해보셨을까요? 저분자면 젤의 %를 높이시거나, 아래까지 다 끌지말고 해당 사이즈 마커까지 2/3정도만 내려주셔야 안 끌립니다!

lee (비회원)
2023.06.14 14:53

채택답변
질문자가 채택한 답변입니다.

SDS-PAGE가 깔끔하게 단백질들이 분리되려면 높은 순도의 단백질들이라면 좋겠죠. 당연히 단백질외에 불순물이 많을수록 SDS-PAGE의 단백질 separation이 좋지 않을겁니다. 이는 단백질의 separation 뿐만 아니라 단백질의 정량에도 영향을 미치게됩니다.

조직들을 파쇄후 extract를 SDS-PAGE를 수행한것은 세포를 lysis시킨것보다 단백질 정량에도 error가 나타나기쉽고, SDS-PAGE를 해도 separation이 깔끔하지 않는 경우가 많습니다. 손을 잡는것도 유성처럼 끌리기도 합니다. 많은 논문의 data에서도 다양한 조직별로 또는 여러 사람의 동일한 조직들에서 특정 유전자의 발현을 볼경우 많이 끌리거나 actin의 량이 들쑥날쑥 하기도 합니다.

최대한 protease inhibitor를 잘 넣어주고 lysis조건을 최적으로 해주고 정량을한 후 단백질 denaturation을 충분히 해주는 수밖에는 딱히 할수 있는게 없을수 있습니다.

어쩔수없이 actin의 량을 보정해서 발현량을 비교할수도 있습니다.

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