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western blot beta-actin 발현 관련 질문이요

레벨1 ilili (과기인)

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Beta-actin은 house keeping gene으로써 일정한 발현을 보여야하는데,

그렇게 안나와서요. 이유가 무엇일까요?

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답변 4

단백질 정량 문제입니다!

파이펫팅 오차 범위가 큰 거 같아요~ 이 부분 주의해서 다시 해보시면 좋을 거 같습니다 :)

전 단백질 sample 만들 때 파이펫팅을 pre-wetting 방법으로 파이펫팅 진행하여 로딩하고 있습니다~! 이부분도 찾아보시면 좋을 거 같아요

혹시 mouse tissue인가요? mouse tissue 샘플은 단백질 추출이 제대로 되지 않고 정량도 제대로 안되는 경우도 있습니다. western 문제라기 보다 단백질 추출 문제가 아닐까 생각이 됩니다.

1. 각 샘플간 조직양과 lysis buffer 비율 맞추기.

2. 원심분리로 침전물 완전히 제거 하기.

3. 실험에 사용된 시료가 actin 발현에 영향을 미치는지 확인해 볼것

- actin/gapdh를 흔히 사용하지만..조금 찾아보시면 조직마다 권장하는 loading control이 있습니다.

안녕하세요 저도 지금 작성자님과 동일한 문제로 고민중인데 혹시 어떻게 해결하셨는지 알수있을까요 ? ㅜㅜ