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레벨8
SPEED
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2023.06.08 19:53
1번에서 3개의 peak fraction을 각각 pooling한 후 각각 peak를 확인했나요?
2번에서 prep.전에 peak를 확인했나요?
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레벨1
hulkim
(대학원생)
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2023.06.08 20:11
영린기기 제품을 사용중에 있습니다. 다만 이게 원래 prep LC 모델은 아니고 분석용 LC입니다. 번거롭긴 하나 Outlet 라인에서 나오는 이동상을 수동으로 직접 받아 분리를 진행중에 있습니다...!
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레벨1
hulkim
(대학원생)
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2023.06.08 20:16
1번 2번 모두 peak을 확인했지만 메탄올로 2차 분리를 진행 한 후 peak 확인에서 peak이 전부 갑자기 분리가 되었습니다.
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레벨8
SPEED
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2023.06.08 22:32
분석용으로 분획할 경우 종종 발생합니다.
pooling이 잘못되어서 그렇습니다.
detector에서 line 길이의 시간을 계산했나요?
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레벨1
hulkim
(대학원생)
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2023.06.09 10:24
SPEED 선생님께,
pooling이 잘못되었을 수도 있다는말이 잘 이해가 가지 않습니다... 어느 시점에서 pooling이 잘못되었다는 것일까요? 2차 분리를 위해 methanol을 이용하여 분리를 하려는 시점에서 pooling이 잘못되었을수도 있다는 말씀을 하시는건가요??
그리고 detector의 line 길이는 따로 계산하지 않았습니다...!
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레벨8
SPEED
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2023.06.09 11:49
1. 1차 분획 시 peak나오는 시간에서 시료 분획을 한거 아닌가요?
2. 1차 3개 peak를 분획하고 나온 시료를 농축 전에 바로 분석했나요?
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레벨1
hulkim
(대학원생)
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2023.06.09 14:28
1. 맞습니다.
2. 농축전에 미리 시료를 메탄올에 녹여서 그것을 분석용 LC로 확인했을때 기존에 나오던 같은 retention time에 동일하게 나오는것을 확인하였고 이때 peak 또한 샤프한 단일픽 형태로 관찰이 되었습니다.
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레벨8
SPEED
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2023.06.09 14:41
1. 분석용 LC의 RT는 검출 시간이고 line에서 나오는 시간이 아닙니다.
2. line 길이를 보정해야 합니다.
3. 분획했을 때 액체 상태인데 메탄올에 녹여서 분석했다는 것은 어떤 의미인가요?
4. 분획할 때 시료는 어디에 녹아 있나요?
5. SpeedVac 후 바로 분획하지 말고 분석해 보세요.
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레벨1
hulkim
(대학원생)
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2023.06.09 15:24
1,2: 모두 무슨 말씀하시는진 알겠습니다. 답변은 3번이랑은 연관이 되어있는것같아서 3번에서 다시 답변드리겠습니다.
3. 분획했을때는 Water + ACN 상태이기이에 이를 스피드백으로 날리고 샘플 농축을 위해 여러 글래스 바이얼을 한데 합하기위해 메탄올에 다시 녹였습니다. 농축된 샘플을 분석용 LC로 분석했을때는 원하던 리텐션 타임에 정확한 물질이 나오는것을 일단 확인했습니다. 그래서 1,2번에 해당하는 분획 방법에는 그렇게 문제가 있을것 같지는 않습니다. 근데 2차 분리때 메탄올을 이동상으로 분리를 시도하기만 하면 원래의 peak은 사라지고 다른 retention time의 여러 peak들이 다양하게 관찰이 됩니다...
4. 분획할떄 시료는 Water와 ACN에 녹아 있는 상태이고 3번과 마찬가지로 분석 할떄는 이를 스피드백으로 다 날리고 메탄올로 샘플 농축을 합니다. 물질의 양이 적어 사이클을 여러번 돌아 샘플을 분획한 후 스피드백으로 날리고 메탄올로 농축시키는 작업을 합니다.
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레벨8
SPEED
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2023.06.10 15:13
제일 처음 시료는 어디에 녹아 있나요?
1차 분획후 peak확인 시 이동상은 MeOH를 사용했나요?
isocratic으로 1차 분리 한 peak를 linear gradient로 단일 peak인지 확인하고 실험을 진행하는 것이 좋을 듯 합니다.
1차, 2차 확인 시 이동상이 다른 이유가 있나요?
line 보정은 반드시 해야하며 수율과 관계있습니다.
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레벨1
hulkim
(대학원생)
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2023.06.11 10:24
1. 제일 처음 시료는 sample culture broth 상태입니다. sample culture broth를 cell down 후에 filtration을 통해 sterilization을 진행하였고 이를 prep LC에 injection 하였습니다.
2. 1차 분획후에 peak은 기존에 관찰하였던 원래 분석용 LC 조건인 water 와 ACN gradient reverse phase HPLC로 단일 peak을 확인하였습니다.
3. 1차 2차 분리시 이동상이 다른 이유로는 같은 이동상을 다른 농도로 분리를 진행하는것보다 methanol을 이용하게 되면 다른 분리능을 통해 혹시 섞여있을 다른 peak들을 분리하기 위함이었습니다.
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레벨8
SPEED
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2023.06.11 14:41
1차 분리 조건은 gradient가 아니라 질문에 12% isocratic으로 나와있습니다만.
배양액이 시료면 메탄올에 녹이면 안됩니다.
전체적인 실험 디자인을 수정하는 것이 좋을 듯 보입니다.
