5% skim milk... 왜 아무것도 안 나올까요? | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q 5% skim milk... 왜 아무것도 안 나올까요?

레벨03 Brady (대학원생)

23.06.05 20:47
조회5360

안녕하세요, western blot 수련생입니다.

biosesang 꺼 blocking buffer 사용하다가

background, 비특이 밴드가 사라지지 않아서

5% skim milk(서울탈지분유) 만들어서 사용 했는데요,

밴드가 하나도 안 나오네요.. 아무것도 없는 까만 화면만 나옵니다.

멤브레인 전체가 문제인가 했지만 기존에 사용하던 blocking buffer로 항체 처리한 부분은 잘 나오네요..

원인이 뭘까요..? skim milk가 좋다고 해서 기대했는데 나오지 않아서 당황스러워서 질문 드립니다.

5% skim milk PBST에 colloid 형태로 녹이고 항체 희석해서 사용했습니다.

blocking 2시간 정도 하였고,

1차 1:1000 (santa cruz) 19시간 정도 o/n, 2차 1:5000 1시간 진행했습니다.

Mol. Biol.-Protein > Western Blot

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A 답변 5

레벨01 dd (비회원)
23.06.05 22:52

BSA 사용해보시거나 skim milk를 식품용 말고 bio grade로 사보시는건 어떨까요?

답변리플

레벨03 웨스턴공장매니저
23.06.06 17:20

혹시 1차항체 희석 조성이 어떻게 되는지요,

저같은 경우는 1차항체는 1% BSA in TBST, 2차항체는 5% skim milk in TBST로 희석해 사용합니다.

이또한 비특이적 결합을 방지하는 목적이지요.

하지만 제 경험상, backgroung가 심한 것이 아니라 명확한 비특이적 밴드가 나온다면 그건 결국 1차항체가 갖는 non-specific target이더라구요. 제조사는 부정할지 몰라도...

데이터로 못쓸만큼 타겟과 가까이 있는 것이 아니라면, 감안하고 쓰셔도 될것같습니다. 어차피 타겟 size는 알고 계실테니까요.

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레벨03 Brady
23.06.06 22:25
질문자

ㄴ 웨스턴 공장매니저님,

1차 항체도 동일하게 5% skim milk에 희석했습니다.

밴드가 선명하지 않아서 background를 없애려고 시도하고 있습니다.

혹시 1차 2차 항체 blocking reagent를 달리 하는 이유를 알 수 있을까요?

답변리플

레벨05 CBD 김선우
23.06.07 08:40

1. 예전 질문글을 보니 p-mtor를 보려고 하시는 것 같던데

skim milk안에는 많은 phospho protein이 존재하여 웨스턴으로 phospho protein을 보려고 할 때 background가 잡힐 수 있기에 skim milk 대신 BSA로 blocking을 진행하라는 의견들이 많습니다. 다만 cell signaling technology 회사는 자기들의 경험상 skim milk로 blocking 해도 phospho protein 보는데 문제 없다고 주장하고, 제가 사용한 대부분의 anti-phospho protein 항체들은 cell signaling 제품이라 skim milk로 해도 별 문제 없긴 했습니다. 산타크루즈 제품 쓰신다면 어떨지는 모르겠네요.

2. 제가 본 대부분의 protocol들은 웨스턴에 TBS를 사용하는데 PBS를 사용하시는 건 좀 생소하네요.

답변리플

레벨03 웨스턴공장매니저
23.06.07 15:34

skim milk는 재사용을 하게 되면 컨탐이 잘나서요, 1차항체는 여러번 재사용하기 위해서 BSA 조성을 사용하고(방부제 역할의 NaAc도 첨가해요) 2차항체는 재사용을 한두번만 하기때문에 그냥 blocking으로 만들어둔 5% skim milk에 희석해서 사용합니다. 큰 이유는 아닙니다.

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